鼻咽癌是一种常见的起源于鼻咽上皮的头颈部肿瘤，2020年新增病例约133,354例，相关死亡病例80,008例。与其他癌症相比，鼻咽癌的地理分布不均衡，约70%的新发病例在东亚和东南亚。由于鼻咽癌解剖位置隐蔽，早期缺乏特异性症状，70%的鼻咽癌患者在初诊时通常诊断为局部晚期。肿瘤转移是鼻咽癌患者死亡的主要原因，因此，阐明鼻咽癌转移的分子机制对寻找更有效的治疗方法至关重要。

TBL1X由位于Xp22.3基因组区域的TBL1X基因编码，该基因包含F-box和WD40重复域，是SMRT-核受体和辅助抑制因子(N-COR)复合物的核心成分。据报道，TBL1X作为一种癌基因，通过直接调控不同蛋白的表达，促进多种肿瘤的发生发展。例如，TBL1X作为ZEB1的辅助因子调控CDH1的表达，从而促进乳腺癌细胞的EMT, TBL1X的高表达有助于乳腺癌的转移，并与乳腺癌患者的不良预后相关；Tegavivint通过干扰β-catenin和TBL1的结合而抑制骨肉瘤的化疗耐药和转移；TBL1/TBLR1的类泛素化修饰促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭；在胰腺导管腺癌中，TBL1X是一个恶性检查点。然而，TBL1X在鼻咽癌转移中的作用尚不清楚。

Flotillin-2 (Flot2)是一种脂筏特征蛋白，已被证明调控肿瘤细胞周期、增殖、迁移和侵袭，这些是肿瘤发展的关键过程。Flot2在胶质瘤、乳腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、肝细胞癌、肺癌和口腔鳞状细胞癌中表达上调。在之前的研究中，作者利用抑制性消减杂交技术鉴定出，Flot2是一个在5-8F（高成瘤、高转移）和6-10B（成瘤、不转移）鼻咽癌细胞间差异表达的基因，在5-8F细胞中表达明显更高。此外，作者发现Flot2通过激活NF-κB和PI3K/Akt3信号通路促进鼻咽癌的发展，其表达上调可诱导异常的肿瘤细胞周期、凋亡、迁移和侵袭等特征。然而，Flot2在鼻咽癌中的作用和调控机制还需要进一步的研究。

研究路线

研究内容

1、TBL1X在鼻咽癌中的表达及临床意义

2、TBL1X通过调控EMT通路增强了鼻咽癌细胞的迁移和侵袭

为了研究TBL1X在鼻咽癌细胞中的潜在功能，作者构建了5-8FshTBL1X、c666-1shTBL1X、6-10B-TBL1X和HK-1-TBL1X细胞系。Transwell侵袭实验表明，TBL1X表达的降低抑制了使用两种不同siTBL1X序列的5-8F和c666-1细胞的侵袭，而TBL1X的过表达增加了6-10B和HK-1细胞的侵袭。划痕实验显示，TBL1X基因的表达敲除显著减少了5-8F和c666-1细胞的迁移，而TBL1X的过表达增强了6-10B和HK-1细胞的迁移。与这些结果一致，western blotting结果显示，TBL1X基因的表达下调增加了E-cadherin的表达，降低了Vimentin的表达。而TBL1X的过表达导致E-cadherin的表达减少，Vimentin的表达增加。这些结果表明，TBL1X通过改变鼻咽癌细胞的EMT通路而影响鼻咽癌细胞的侵袭和迁移。

3、TBL1X通过增强Flot2的表达而促进EMT

为了研究TBL1X在鼻咽癌中潜在的分子机制，作者根据TBL1X在TCGA数据集中的表达中位数将所有肿瘤样本分为高表达组和低表达组。首先，作者通过GSEA分析了TBL1X低表达组和高表达组之间差异激活的通路。结果表明，TBL1X的低表达与粘附分子显著相关。同时，TBL1X的高表达与Wnt信号通路呈正相关。TCF4作为一种转录因子，是Wnt信号转导的关键组成部分。本研究中，免疫荧光染色和Co-IP实验显示，TBL1X和TCF4在鼻咽癌细胞中形成蛋白-蛋白复合物。因此，TBL1X可能与TCF4一起调控下游基因的表达。作者通过CHEV、ENCODE、JASPAR、MotifMap、TRANSFAC等网站筛选出可能受TBL1X和TCF4调控的基因。然后，作者对相关基因的潜在功能进行了深入的功能富集分析，发现在GO细胞成分的前20个条目中，最显著的条目是粘着连接。有趣的是，Flot2归属于几个GO条目，如：粘着连接、质膜蛋白复合物、细胞质区、膜区、膜筏和膜微域。这些结果表明，Flot2可能参与了TBL1X的调控网络。

为了进一步确定TBL1X在Flot2表达中的作用，作者进行了qRT-PCR和western blotting检测，结果表明，在5-8F细胞中，使用两种不同的siRNA序列敲低TBL1X或TCF4的表达后，Flot2的mRNA和蛋白水平都降低了。TBL1X或TCF4的过表达均可导致Flot2表达增加。然后，作者使用ALGGEN PROMO和JASPAR在线工具在Flot2的启动子区域确定了一个共同的TCF4结合位点。使用抗TBL1X、抗TCF4抗体在5-8F细胞进行ChIP检测，IgG作为阴性对照抗体。结果表明，包含预测的TCF4结合位点的序列被放大。TBL1X/TCF4复合物可以直接绑定到Flot2启动子区域。将Flot2启动子区片段(包括野生型或TCF4结合位点突变)插入pGL3-basic质粒中构建报告基因载体。结果表明，在5-8F细胞中，TCF4或TBL1X的表达敲除显著降低了转染野生型Flot2启动子质粒的细胞的荧光素酶活性，但在转染突变型Flot2质粒的细胞中没有降低荧光素酶活性。在转染TBL1X或TCF4表达质粒后，在转染野生型Flot2启动子质粒的6-10B细胞中，荧光素酶活性显著增加，而在转染突变型Flot2质粒的细胞中，荧光素酶活性则没有增加。这些结果表明，TBL1X可以和TCF4形成蛋白-蛋白复合物，通过与Flot2基因的启动子区结合，在转录水平上增加Flot2的表达。

以上实验表明，Flot2受TBL1X的调控。因此，作者分析Flot2是否会逆转TBL1X的表达改变对鼻咽癌细胞功能的影响。将Flot2表达质粒转染入TBL1X基因敲除的细胞。结果表明，Flot2的过表达显著提高了TBL1X基因敲除细胞的侵袭和迁移能力。将shFlot2质粒转染入TBL1X过表达的细胞，结果显示，Flot2的表达降低显著抑制了TBL1X过表达所介导的鼻咽癌细胞迁移和侵袭。通过尾静脉注射5-8Fcontrol、5-8FshTBL1X和5-8FshTBL1X+oeFlot2细胞，作者构建了小鼠鼻咽癌肺转移模型。检测结果表明，5-8FshTBL1X组肺转移结节数明显低于5-8Fcontrol组，5-8FshTBL1X+oeFlot2组肺转移结节数明显高于5-8FshTBL1X组。HE染色与此结果一致。

4、Flot2通过c-myc调控TBL1X的表达

在之前的研究中，作者使用基因芯片(GSE67456)鉴定了Flot2表达缺失的鼻咽癌细胞中差异表达的mRNA。TBL1X基因是Flot2表达缺失的鼻咽癌细胞中表达下调的基因之一。通过qRT-PCR和western blotting检测，作者发现两种不同siFlot2序列介导的Flot2基因敲除均会降低TBL1X基因的表达水平，而Flot2的过表达会增加TBL1X基因的表达水平。c-myc已被证明在鼻咽癌中表达上调。作者的实验结果表明，Flot2表达敲除后，c-myc表达降低；Flot2过表达后，c-myc蛋白水平升高。在5-8FshFlot2细胞中，c-myc的过表达增加了TBL1X的表达。c-myc是一种重要的转录因子。为了进一步研究c-myc是否直接调控TBL1X的表达，作者利用UCSC、PROMO和JASPAR数据库，在TBL1X基因启动子区寻找c-myc可能的结合位点。共鉴定出2个位点，即：位点1(-885至-874)和位点2(-71至-60)。然后作者用ChIP实验检测了它们与c-myc的结合，结果显示，c-myc更容易与位点1结合。ChIP结果显示，c-myc沉淀的复合物中TBL1X的富集明显高于IgG沉淀的复合物。然后，作者将TBL1X基因5 '启动子区域的2kb片段插入pGL3-basic质粒中，构建了TBL1X启动子-荧光素酶报告质粒，同时也构建了c-myc结合位点突变的质粒。在c-myc表达缺失后，转染野生型质粒的5-8F细胞的荧光素酶活性显著降低，而转染突变型质粒的细胞则没有降低。在转染了野生型质粒的6-10B细胞中，c-myc的过表达增加了荧光素酶活性，而在转染了突变型质粒的细胞中则没有。综上所述，这些结果表明，Flot2通过调控TBL1X的转录因子c-myc的表达，在转录水平上增加了TBL1X的表达。

考虑到TBL1X受到Flot2-c-myc轴的调控，而c-myc作为转录因子可以直接调控TBL1X的表达，因此作者研究了在Flot2表达发生改变后，TBL1X是否可以挽救鼻咽癌细胞的功能。将TBL1X表达质粒转染入5-8FshFlot2细胞，结果显示，5-8FshFlot2+oeTBL1X细胞的侵袭和迁移能力明显高于5-8FshFlot2细胞。此外，将shTBL1X质粒转染入6-10B-Flot2细胞后，TBL1X表达的减少显著降低了Flot2过表达介导的鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力。同时，作者发现shFlot2组裸鼠肺转移结节明显少于对照组，而shFlot2+oeTBL1X组裸鼠肺转移结节部分增加。HE染色与此结果一致。以上结果提示，TBL1X-Flot2反馈轴在体内促进鼻咽癌转移。

5、TBL1X与Flot2在鼻咽癌中的表达呈正相关

上述结果提示TBL1X-Flot2反馈轴可能影响鼻咽癌转移。接下来，作者研究了TBL1X-Flot2反馈轴的潜在预后价值。首先，作者检测了TBL1X和Flot2在鼻咽癌中的表达相关性。免疫组化结果显示，TBL1X和Flot2在鼻癌组织中表达水平都比较高。Spearman检验结果显示，在GEO batch（含61个鼻咽癌标本）中，TBL1X与Flot2的表达呈正相关(R=0.3209;P=0.0117)。IHC评分和Kaplan-Meier生存分析表明，Flot2高表达的鼻咽癌患者总生存期和无病生存期降低。Flot2表达水平与肿瘤淋巴结转移(TNM)、肿瘤转移显著相关；Flot2表达水平与性别、年龄无显著相关性。更重要的是，TBL1X和Flot2均高表达的鼻咽癌患者的总生存期和无病生存期较两者只有一种高表达的患者明显降低。

研究结论

本研究中，作者确定了一个新的TBL1X-Flot2反馈轴，该反馈轴有助于鼻咽癌转移。TBL1X和Flot2的高表达预示着鼻咽癌患者的不良预后。作者证明了TBL1X和Flot2作为鼻咽癌转移的生物标志物的临床意义，TBL1X-Flot2反馈轴对鼻咽癌患者具有较高的靶向治疗价值。