胃癌(GC)是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，在我国尤为突出。此外，胃癌是中国第三大恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，每年约有67.91万例新诊断病例和49.8万例死亡病例，占全球胃癌相关死亡总数的一半以上。虽然生活条件的改善有助于减少幽门螺杆菌的感染率，但胃癌的临床结果仍不乐观。因此，需要更多的研究以便改善胃癌的预后。
E2F5属于E2F转录因子家族，在多种生理和病理过程中发挥重要作用，尤其是在癌变过程中。此外，E2F5的异常上调已被证实存在于包括乳腺、肝、结肠、食道、前列腺、卵巢和胃等各类肿瘤组织中。E2F5在乳腺癌、卵巢癌和食管鳞癌中是晚期和预后不良的独立指标。E2F5是多种肿瘤抑制miRNAs的靶点，它不仅通过调节细胞周期，还通过调节Hippo和Wnt通路，在促进癌细胞增殖和侵袭以及介导治疗耐药方面发挥作用。虽然E2F5的促肿瘤功能已经为人所知，但其介导致癌作用的转录靶点尚不清楚。最近的一项研究报道，由E2F5转录调控的TFPI2、MMP-2和MMP-9可能介导E2F5在前列腺癌中的致癌功能。然而，在癌症中，更多的E2F5下游靶点尚不清楚。
泛素结合酶E2T (UBE2T)最初被确定为范可尼贫血(FA)综合征的重要调节因子，调控FANCD2和FANCI的单泛素化。此外，UBE2T在实体瘤和血液肿瘤中的表达异常、致癌功能和预后价值已被广泛揭示。在胃癌中，UBE2T的调控是预后不良的独立因素，可促进细胞周期和上皮-间充质转化(EMT)，进而通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进细胞增殖和侵袭。然而，UBE2T在胃癌中过表达的机制尚不清楚。
研究路线
研究内容
1、E2F5在胃癌中表达上调，预示不良预后且与胃癌恶性进展呈正相关
作者使用在线工具分析了E2F5在胃癌中的表达。三个数据库的分析均证实，E2F5在胃癌中显著表达上调。E2F5 mRNA表达上调与胃癌的总生存期(OS)、首次进展生存期(FPS)和复发后生存期(PPS)呈负相关。此外，western blot和qPCR分析同样显示，E2F5在胃癌细胞中表达上调。免疫组化染色结果表明，与癌旁组织相比，胃癌组织中E2F5蛋白表达明显升高，定位于核。E2F5蛋白水平与胃癌的恶性特征呈正相关，包括肿瘤大小、分化状态、原发肿瘤T分期、淋巴结转移、临床TNM分期等。同样，E2F5蛋白水平与胃癌患者的总生存呈负相关。因此，这些发现证明E2F5在胃癌中表达上调，预示预后不良，并与胃癌的恶性进展呈正相关。
2、启动子甲基化参与了胃癌中E2F5的上调
既往研究表明，启动子低甲基化影响E2F5的转录和活性。因此，作者通过分析在线数据来评估胃癌中E2F5启动子的甲基化状态。两个探针(cg1211280和cg14830952)的MethSurv分析结果显示，E2F5启动子的高甲基化可以预测胃癌患者的预后良好。此外，E2F5与胃癌中负责DNA去甲基化的酶TETs家族成员，尤其是TET3，表达有显著的相关性。这些结果提示，启动子的甲基化状态可能参与了胃癌中E2F5的表达调控。因此，作者用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza处理GES-1, AGS和BGC823细胞，然后通过qPCR和western blotting检测E2F5的表达。结果表明，5-Aza处理显著上调了E2F5的mRNA和蛋白水平。此外，作者也研究了E2F5的突变状态，发现E2F5突变频率较低，在胃癌中无预后价值。因此，以上结果提示，启动子低甲基化至少部分参与了胃癌中E2F5的上调。
3、E2F5的表达缺失影响胃癌细胞的增殖和侵袭
为了研究E2F5在胃癌中的作用，作者在HGC27和SGC7901细胞中成功敲除了E2F5的表达。以PCNA可作为评价细胞增殖的指标，CCK-8和平板集落形成的试验结果表明，E2F5的表达敲除可显著抑制胃癌细胞的增殖。此外，Transwell侵袭实验表明，E2F5的表达敲除显著抑制了胃癌细胞的侵袭能力。因此，这些结果表明，E2F5的表达缺失可以抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。
4、E2F5与UBE2T正相关并调控其在胃癌中的表达
作者通过LinkedOmics在线分析平台评估了与E2F5正相关基因在胃癌中的表达情况，并进行GSEA分析。基于KEGG和Reactome数据库的GSEA分析结果表明，相关基因主要富集在细胞周期、G1/S转换、TP53转录调控和范可尼贫血(FA)通路。最近的研究显示，UBE2T作为FA途径的核心基因之一，通过促进细胞周期负调控因子：p53和FOXO1在癌症中的降解而发挥致癌作用。接着，作者研究了UBE2T是否介导了E2F5在胃癌中的作用。结果表明，E2F5与UBE2T在mRNA和蛋白水平上均显著相关。此外，E2F5的表达敲除可显著降低胃癌细胞中UBE2T的mRNA和蛋白水平。这些结果表明，E2F5与UBE2T呈正相关，并调控UBE2T在胃癌中的表达。
5、E2F5在转录水平上调胃癌中UBE2T的表达
由于E2F5是一个转录因子，作者进一步探讨E2F5是否通过直接调控UBE2T在胃癌中的转录而影响UBE2T的表达。作者利用GTRD (Gene Transcription Regulation Database)，探索UBE2T基因组上游E2F5的结合位点。分析表明，在UBE2T转录起始位点(TSS)上游有一个E2F5结合峰，说明E2F5可以直接调控UBE2T的转录。此外，作者在gDNA模板与E2F5的沉淀物中，qPCR检测获得了阳性扩增信号。作者通过荧光素酶报告基因检测了UBE2T的转录调控。结果表明，与野生型UBE2T转染的细胞相比，突变型UBE2T转染的胃癌细胞的相对荧光素酶活性明显降低。这些结果证实了E2F5在胃癌中直接调控UBE2T的转录。
6、UBE2T调控E2F5在胃癌中的致癌作用
为了确定UBE2T是否调控E2F5在胃癌中的致癌作用，作者将UBE2T在E2F5表达敲除的胃癌细胞中异常表达。检测结果表明，E2F5敲除后，UBE2T的异常表达显著恢复了UBE2T的水平。此外，从p53、FOXO1、p21、CCNE1、E-cad和N-cad等蛋白水平的表达变化可以看出，UBE2T过表达挽救了E2F5对细胞周期和EMT的正调控作用。CCK-8、平板克隆形成和Transwell侵袭试验的结果表明，在功能上，UBE2T的恢复增强了E2F5表达敲除的胃癌细胞的增殖和侵袭。这些结果提示，E2F5通过UBE2T促进胃癌细胞的增殖和侵袭。
研究结论
本研究证实E2F5在胃癌中表达上调并具有致癌功能。重要的是，本研究证明E2F5能够结合UBE2T的启动子区域，促进其转录，进而促进E2F5在胃癌中的致癌功能。因此，作者的研究初步确定了E2F5的一个新的转录靶点，为胃癌的分子机制提供了更多的见解，并突出了E2F5/UBE2T轴在胃癌诊断和治疗中的潜在应用价值。
参考文献
Li L, Liu J, Huang W. E2F5 promotes proliferation and invasion of gastric cancer through directly upregulating UBE2T transcription[J]. Digestive and Liver Disease, 2021.
