一般来说，肿瘤转移在远端器官间不是随机分布的。肿瘤细胞的扩散主要有三种途径：血行转移、淋巴转移和腹膜扩散。不同的肿瘤类型和亚型对转移器官和途径表现出不同的偏好。卵巢癌和胃肠道癌的一些亚型均表现为腹膜扩散；当癌细胞被动地从原发病灶释放并植入腹膜时，就会发生。相比之下，大多数实体瘤通过血行和/或淋巴途径进行主动转移。临床上，只有少数类型的实体肿瘤将淋巴管作为首选转移途径，包括：头颈部鳞癌、食管癌、皮肤黑色素瘤和睾丸癌，而其他类型的肿瘤则有较高的通过血管转移的倾向。研究表明，选择特定转移途径的偏好可能受到几个因素的影响，包括：特定器官的循环模式、癌细胞的固有特性、血管或器官特异性niche和宿主免疫微环境。最近一项基于超过25000名原发性和转移性肿瘤患者的基因组测序研究显示，在泛癌水平，没有与器官特异性转移相关的显著基因组或通路改变。目前尚不清楚肿瘤细胞为何偏爱特定的转移途径。
铁死亡是一种铁依赖性的非凋亡调控的细胞死亡方式，在磷脂介导的膜损伤过程中，通过PUFAs的过度过氧化而发生。因此，从理论上讲，调节细胞内外铁含量、细胞膜脂质组成和氧化应激的基因会影响对铁死亡的敏感性。细胞至少具有三种抗氧化系统来减轻脂质过氧化，包括众所周知的GSH/GPX4轴、FSP1/辅酶Q10系统和新报道的BH4系统。调控氧化应激反应的转录因子也有助于铁死亡，包括：驱动基因NFE2L2、转录因子BTB和BACH1。
铁死亡已被发现可导致多种人类疾病，而铁死亡在肿瘤发生中似乎是一把双刃剑。根据最近的研究结果，淋巴似乎通过逃避铁死亡来加强弥散性肿瘤细胞的生存能力，而血液则通过诱导铁死亡来充当筛选转移性肿瘤细胞的过滤器。基于这种机制，淋巴转移应该是主要的转移途径。然而，临床上实体瘤最主要的转移途径是血行转移。这就提出了一种可能性，即不同类型的肿瘤表现出不同的内在特征和对铁死亡的敏感性，从而积极参与转移路径的选择。
食管鳞状细胞癌(ESCC)是全球致命的恶性肿瘤之一。尽管早期检测、手术技术和放化疗方法取得了进步，食管癌的预后仍然很差，5年生存率为15-25%。淋巴结转移患者的预后往往比没有转移的患者差。转移淋巴结的数量和比例已被证明是重要的预后因素。
研究路线
作者从FerrDB数据库中选取经实验验证过的铁死亡相关基因，并将其分为三类，包括：124个驱动基因、106个抑制基因和9个双重作用基因。随后，作者从TCGA下载了涵盖17种常见癌症的8247个样本的转录组测序数据。除皮肤黑色素瘤(SKCM)外，其余类型肿瘤均有超过10个的癌旁组织样本。SKCM数据集包括：368个转移灶样本和103个原发灶样本。作者比较了SKCM转移瘤与原发肿瘤之间的差异，而肿瘤与癌旁组织之间的差异将在其余类型肿瘤进行分析。作者提取了各类肿瘤中铁死亡相关基因的表达数据，只保留差异表达基因进行进一步分析。
无监督聚类分析显示，在优先淋巴转移(淋巴结转移为第一转移途径)的肿瘤，包括：黑色素瘤、食管癌(ESCA)和头颈部鳞状细胞癌(HNSC)中，铁死亡相关基因的表达模式与非优先淋巴转移的肿瘤不同。包括BACH1在内的一小组基因在三种以淋巴转移为主的肿瘤中都过表达。血行转移肿瘤之间存在显著的异质性。部分肿瘤，如：肾癌、甲状腺癌、前列腺癌，呈现铁死亡抑制基因和驱动基因同时低表达的趋势；而肝癌、子宫内膜癌、肺鳞癌等肿瘤，则呈现铁死亡抑制基因和驱动基因同时高表达的趋势。这些结果表明，不同的铁死亡敏感性可能是肿瘤的内在特征，故而优先使用不同的转移途径。
2、在早期食管癌患者中筛查与淋巴结转移相关的血清自身抗体
食管癌是一种偏好淋巴转移途径的典型肿瘤，这说明转移细胞有更早、更大的机会接触淋巴结内的免疫细胞而激活体液免疫。作者首先筛查了淋巴结发生转移的早期食管癌患者的血清自身抗体。T1期食管癌患者(即肿瘤侵袭深度不超过粘膜下层)、不同淋巴结转移状态的患者和健康对照组的血清进行了HuProt蛋白质组芯片检测，该芯片覆盖了大约75%的人类蛋白质组。鉴别点的标准为：肿瘤组阳性率大于50%，肿瘤组最小信号值大于对照组中位数。肿瘤组与对照组、T1N0M0组与T1N1M0组之间平均信号值的差异倍数大于1.5的蛋白点均被认为是候选自身抗原。分析表明，分别有130、284个IgG自身抗体被鉴定为与食管癌、淋巴结转移潜在相关的蛋白。此外，41种血清自身抗体在所有食管癌病例中均高表达，特别是在伴有淋巴结转移的患者中。
3、BACH1的自身抗体在伴有淋巴结转移的早期食管癌患者中被发现
将这两个自身抗体差异数据集与铁死亡相关基因列表进行比对，发现只有9个铁死亡相关蛋白在食管癌中产生血清自身抗体。PPP1R13L、BACH1和SESN2在三个数据集中均有出现。作者随后通过泛癌分析评估了这9个基因的表达特征。只有BACH1在优先淋巴转移的肿瘤中显著过表达，且在大多数非优先淋巴转移的肿瘤中表达下调。
分析表明，BACH1血清自身抗体对食管癌淋巴结转移的鉴别能力最高。在发现队列中，BACH1血清自身抗体的敏感性和特异性均达到100%；其在健康个体中的荧光强度极低，在无淋巴结转移的食管癌患者中的荧光强度较弱。然而，在淋巴结转移患者中，其平均水平增加了4倍。这些结果表明，BACH1是淋巴转移的特异性调控分子。
4、食管癌中BACH1自身抗体的独立验证
作者使用一个更大的独立队列，包含：122名健康对照、39名早期食管癌患者、50名无淋巴结转移的食管癌患者和78名有淋巴结转移的食管癌患者，通过免疫印迹法验证了BACH1自身抗体。BACH1自身抗体在食管癌患者中的相对强度明显高于健康对照组，早期食管癌患者与对照组差异尤其显著。重要的是，有淋巴结转移的患者的相对强度也明显高于没有淋巴结转移的患者。以健康对照组的平均强度3为截断值时，BACH1自身抗体阳性百分率在健康对照组为2.5% (3/122)，食管癌组为24.8%(30/128)，早期食管癌组为12.8%(5/39)，无淋巴结转移食管癌组为12%(6/50)，有淋巴结转移食管癌组为30.8%(24/78)。食管癌自身抗体水平与淋巴结转移(P=0.0145)和AJCC分期(P= 0.0012)显著相关；而与年龄、性别、组织学分级、肿瘤部位、肿瘤大小、T分期、M分期均无相关性。
通过受试者工作特征曲线分析评估了BACH1自身抗体识别食管癌、早期食管癌和伴淋巴结转移食管癌的性能。曲线下面积(AUC)分别为：0.767、0.695和0.672；特异性为95%，敏感度分别为：32.8%、20.5%和14.1%。
5、BACH1在食管癌组织中的蛋白水平升高与淋巴结转移有关
作者使用组织芯片进行了BACH1免疫组化染色试验，研究了BACH1血清自身抗体水平升高是否对应食管癌肿瘤组织中抗原水平升高。结果表明，BACH1在癌旁组织和肿瘤组织中的阳性率分别为：9.7%(28/289)和31.5%(181/574)，表明BACH1在食管癌中显著过表达。此外，与N0期肿瘤相比，BACH1在N1-3期肿瘤中的蛋白表达上调，这可能是BACH1血清自身抗体水平升高的潜在原因。另外，BACH1的高表达与食管癌的分化程度、AJCC分期以及预后不良均呈显著正相关。阳性表达组和阴性表达组的中位总生存期分别为23个月和31个月。
6、BACH1可诱导食管癌细胞铁死亡
作者首先在6个食管癌细胞系：KYSE150、KYSE170、KYSE180、KYSE30、KYSE410和KYSE510中检测了BACH1、SLC7A11、GPX4和ACSL4的蛋白表达以及对铁死亡诱导物RSL3的敏感性。结果显示，BACH1的表达与RSL3对食管癌细胞的IC50值呈显著负相关，而其他蛋白无显著相关性。
接下来，作者构建了BACH1稳定表达敲除的KYSE170和KYSE150细胞系，以及BACH1过表达的KYSE150细胞系，并测定了RSL3对不同BACH1表达水平的KYSE150和KYSE170细胞的IC50值，结果表明，与野生型细胞相比，过表达(BACH1-OE))组的IC50值降低，稳定敲低(shBACH1)组的IC50值增加。C11-BODIPY591/581染色后的流式细胞分析显示，与野生型细胞(1.8%)相比，BACH1-OE细胞的脂质ROS百分比增加到15.8%，而shBACH1细胞的脂质ROS百分比下降到1.1%。相差显微镜显示，添加1μM RSL3后，BACH1-OE细胞变圆并漂浮，而对照组细胞无明显变化。透射电镜显示，在1μM RSL3的作用下，BACH1-OE细胞线粒体数量减少，膜密度增大，嵴数量减少，这与铁死亡的形态变化一致。这些发现表明，BACH1增加了食管癌细胞对铁死亡的敏感性。
7、BACH1在食管癌体内促进淋巴结转移，但抑制血行转移
作者构建了足垫接种裸鼠模型，以评估BACH1在无胸腺裸鼠的淋巴结转移中的体内作用。结果表明，BACH1的过表达增加了转移淋巴结的大小、重量和阳性百分比(100%比25%)，而BACH1的稳定敲除则产生相反的效果。随后，作者通过尾静脉注射对照组或KYSE150-BACH1-OE细胞，研究了BACH1对血行转移的影响，发现BACH1-OE细胞的肺转移率显著降低。
为了验证铁死亡对体内肿瘤生长和转移的影响，作者首先给皮下异种移植瘤模型小鼠腹腔注射30mg/kg RSL3或10mg/kg Liprox-1 (铁死亡抑制剂)，每2天注射一次，连续20天。结果表明，Liprox-1轻微促进肿瘤生长，而RSL3如预期所料没有抑制作用。此外，作者用1μM RSL3预处理对照组和KYSE150-BACH1-OE细胞6小时，皮下成瘤实验表明，BACH1-OE细胞的体内增殖和肿瘤重量显著降低。接下来，作者使用足垫接种裸鼠模型，发现与对照组(DMSO)相比，腹腔注射RSL3显著促进了腘窝淋巴结转移(16.7%比83.3%)，而使用Liprox-1无明显作用。这些结果表明，BACH1以依赖铁死亡的方式促进了食管癌的淋巴结转移，但抑制了食管癌的血行转移，而铁死亡本身抑制了皮下肿瘤的生长，同时促进了淋巴结转移。
8、BACH1抑制MUFA的生物合成从而诱导铁死亡
为了评估BACH1诱导的铁死亡和淋巴结转移的机制，作者对对照组和KYSE150-BACH1-OE细胞进行了转录组测序分析。KEGG富集分析显示，除了铁死亡外，差异表达基因在脂肪酸代谢相关途径富集。基因集富集分析还显示，BACH1的过表达负向调控了铁死亡和SREBP信号通路。
脂肪酸的合成和代谢途径已被报道与铁死亡有关。因此，作者对KYSE150-BACH1-OE和对照细胞进行脂质组学分析。热图分析显示，BACH1的过表达后细胞内脂质组成发生明显变化。具体而言，BACH1的过表达导致含单不饱和脂肪酸(MUFA)磷脂的产量显著下降，而PUFA磷脂(18:0/20:4)和磷脂酰乙醇胺(18:0/22:4)的产量有不同程度的增加，提示BACH1对食管癌细胞铁死亡相关脂类的影响具有双面性。此外，通过靶向脂质组学定量分析脂肪酸的变化，结果显示，BACH1过表达后中链和长链脂肪酸显著降低。值得注意的是，BACH1-OE细胞的OA显著降低。OA是一种MUFA，通过减少膜中PUFA的数量或密度来抑制铁死亡。因此，BACH1抑制了MUFA的合成，特别是OA，使食管癌细胞更容易发生铁死亡。
9、OA在铁死亡影响下在BACH1过表达的细胞中发挥趋化作用
随后，作者对KYSE150和KYSE170细胞进行了功能恢复实验。结果表明，添加400μM的OA几乎全部逆转了BACH1-OE引起的脂质活性氧(ROS)积累。在RSL3存在的情况下，OA的预处理使细胞活力显著提高。此外，作者对传统的Transwell实验进行了改进，研究了OA在下室的趋化作用，并在上室中加入1μM的RSL3诱导铁死亡。结果表明，与对照组相比，OA吸引BACH1-OE细胞并促进细胞迁移和侵袭。因此，OA的损耗是BACH1诱导的铁死亡的主要效应，外源性OA诱导剂可以保护敏感细胞不受铁死亡的影响。
10、BACH1通过负调控SCD1而抑制OA合成
为了深入研究BACH1抑制OA合成的机制，作者重新分析了转录组测序数据。与对照组相比，BACH1的稳定敲除和过表达分别产生516和56个差异表达基因，其中有10个共同基因。聚类分析显示，两组比较中只有SREBF1、SCD1、KRT17和CCDC80 4个基因表现出相反的趋势。SCD1是催化饱和脂肪酸(主要是OA)转化为MUFAs的速率限制酶，作者因而选择SCD1进行下一步分析。随后的western blot和qPCR检测证实，BACH1负向调控SCD1的mRNA和蛋白水平。此外，作者评估了BACH1表达改变后，SLC7A11、GPX4和ACSL4的表达情况。与转录组测序数据一致，BACH1的过表达和敲除对这些基因的mRNA水平没有产生相反的影响。但它们的蛋白表达水平与SCD1呈相似趋势。因此，BACH1似乎没有在转录水平调控这三种铁死亡的调控因子，而BACH1诱导的铁死亡伴随着铁死亡效应物SLC7A11和GPX4的下调。
然后，作者评估了SCD1与BACH1在临床标本中表达的相关性，免疫组化染色检测显示，SCD1在鼻咽癌组织中显著下调(n=295)。此外，BACH1与SCD1的蛋白表达水平呈负相关(P=0.0018，卡方检验)。
作者在KYSE150和KYSE170细胞中将SCD1表达敲除或过表达。SCD1的表达敲除显著增加了两种细胞系的脂质ROS积累，而过表达则略微降低了细胞内脂质ROS水平。在不同处理条件下，用荧光显微镜观察细胞脂质ROS水平。与对照组相比，BACH1-OE组和siSCD1组的肿瘤细胞都显示出更多的氧化脂质(绿色荧光)，而OA的添加显著减弱了氧化表型。此外，作者还研究了OA在体内肺转移中的作用。作者向KYSE150-BACH1-OE细胞注射OA作为预处理，与未进行OA预处理的组相比，其肺转移灶的大小和数量明显增加。这些结果共同证明，BACH1诱导的铁死亡是通过抑制SCD1催化的OA合成而调控的。
11、BACH1在转录水平抑制SCD1的表达
为了进一步证实BACH1对SCD1的转录调控作用，作者首先利用JASPAR数据库预测了BACH1在SCD1基因中可能的结合位点。预测结果表明，在启动子区域没有预测到结合位点，而在内含子2中有三个推测的位点。然后，作者设计了三个假定的结合位点的引物，并进行了ChIP-PCR检测。结果表明，BACH1可以与SCD1基因内含子2的这些位点结合。此外，作者将来自SCD1内含子2的一个3kb插入片段(Chr10:100348450-100351450)和包含三个假设结合位点(SCD1-1和SCD1- 2)的两个截头(约700bp)构建成荧光素酶报告载体。与对照组相比，BACH1表达敲除细胞中的相对荧光素酶活性显著增加，BACH1-OE细胞中相对荧光素酶活性被抑制。然而，BACH1的三个假定结合位点的突变导致其抑制SCD1报告基因转录的能力丧失。因此，这些发现表明，BACH1在食管癌细胞中通过与SCD1内含子区结合而在转录水平抑制SCD1。
研究结论
本研究中，作者发现实体瘤对铁死亡的敏感性存在天然差异，高敏感性肿瘤细胞倾向于优先选择淋巴转移途径。作者还发现BACH1血清自身抗体是检测早期淋巴结转移的有前景的生物标志物。在OA介导的肿瘤细胞趋化过程中，BACH1诱导的铁死亡促进淋巴转移，但通过新的BACH1-SCD1轴抑制血行转移。这些发现突出了BACH1在转移路径选择中的作用，阐明了铁死亡通过促进肿瘤转移而产生的不良反应，为铁死亡相关药物的临床应用提供了参考。
