结直肠癌(CRC)是最常见且致命的肿瘤类型之一，晚期并伴有转移性疾病的患者死亡率特别高。结直肠癌的治疗方法包括：手术、化疗、放疗和靶向治疗等，化疗是普遍采用的基石治疗策略。目前，5-FU仍是治疗结直肠癌最常用的化疗药物之一，其作用机制是不可逆地抑制胸腺苷合成酶，导致DNA合成受损。目前，对5-FU的治疗耐受是结直肠癌患者获得有效的系统化疗治疗的主要障碍。
上皮-间充质转化(EMT)是细胞通过一系列保守机制摆脱上皮细胞特征而获得间充质特征的过程。上皮细胞经EMT诱导后失去极性并从基底膜分离，从而获得间充质样特性，包括：迁移和侵袭能力的增强、肿瘤干细胞特征和凋亡耐受。多项研究表明，EMT与化疗耐药的出现有关。一系列重要的信号通路，包括：整合素/EGFR-ERK/MAPK、Wnt和Notch、TGF-β、ETAR、MMPs和缺氧等信号通路调控EMT的诱导和进展。
双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶2 (DYRK2)是DNA损伤修复、细胞周期进展和凋亡性细胞死亡的重要调节因子。多项研究表明，DYRK2可以调控多种肿瘤的EMT诱导。最近的生物信息学分析表明，DYRK2是在结直肠癌中唯一发现的显著下调的激酶。此外，也有证据表明，DYRK2的表达下调与肝转移和患者预后密切相关。然而，目前尚不清楚DYRK2是否参与了结直肠癌化疗耐药的调控，从而影响结直肠癌患者的器官转移和预后。
研究路线
作者通过TIMER数据库初步分析了DYRK2在不同肿瘤中的mRNA表达，分析表明，DYRK2在13种肿瘤中表达上调，在3种肿瘤中表达下调（含结直肠癌）。TCGA数据库的进一步分析显示，相对于邻近正常组织，DYRK2在结直肠癌肿瘤组织中的表达水平显著下调。作者进而使用结直肠癌组织芯片，采用免疫组化(IHC)研究了DYRK2的表达与患者的临床病理特征的相关性。结果显示，DYRK2在65.06%(54/83)的样本中表达水平较低，而与癌旁组织相比，DYRK2仅在34.94%(29/83)的样本中表达水平较低。在这些结直肠癌组织样本中，高级肿瘤分化与DYRK2的表达下调有关。
为了进一步探讨观察到的DYRK2表达变化的临床意义，作者接下来对DYRK2的表达与结直肠癌患者的临床病理特征进行了相关性分析。分析表明，DYRK2的表达与结直肠癌患者的淋巴结转移、肝转移和病理分级有关。此外，在54例DYRK2低水平表达的患者中，21例发生了肝转移。在该患者队列中，DYRK2的表达水平与无病生存期(DFS)和总生存期(OS)之间存在显著相关性。因此，这些数据指出，DYRK2是与结直肠癌患者临床结果相关的预后指标。
2、DYRK2的表达下调与5-FUR LoVo细胞的恶性程度有关
作者进一步检测了DYRK2在不同结直肠细胞系和5-FU耐药细胞(5-FUR)中的表达情况。结果表明，与亲本细胞：LoVo、HCT116、SW480和HCT15相比，DYRK2在LoVo 5-FUR、HCT116 5-FUR和SW480 5-FUR细胞系中的mRNA和蛋白水平均表达下调。然而，DYRK2在HCT15和HCT15 5-FUR细胞间的表达没有差异。与亲本LoVo细胞相比，DYRK2在LoVo 5-FUR中的表达显著降低。接下来，作者探讨了DYRK2作为5-FUR LoVo细胞恶性行为调节因子的潜在作用。CCK-8检测表明，5-FUR LoVo的细胞活力较亲本细胞系增强。5-FU对LoVo和5-FUR LoVo细胞的半抑制浓度(IC50)分别为：4.011 μg/mL和9.608 μg/mL，与后者对5-FU抗性的增加相一致。流式细胞术分析进一步显示，5-FUR LoVo细胞的凋亡率降低，而Transwell分析显示，与亲本细胞相比，它们的迁移和侵袭活性增强。总之，这些数据表明，DYRK2的表达下调与5-FUR LoVo细胞的恶性程度增强有关。
3、DYRK2的表达下调与上皮-间充质表型转化有关
形态学分析显示，与亲本LoVo细胞观察到的间充质表型不同，5-FUR LoVo细胞的形态特征发生了明显的变化，其形态呈梭形、不规则、分散。为了验证这些结果，作者对EMT标记蛋白：Vimentin和E-cadherin进行了免疫荧光染色。结果表明，上皮标志物：E-cadherin在亲代细胞中的表达高于5-FUR LoVo细胞；间充质标志物：Vimentin在亲本LoVo细胞中的表达低于5-FUR LoVo细胞。Western blotting进一步证实了这些结果。因此，这些数据表明，EMT诱导与长时间暴露于5-FU后获得性化疗耐药有关。
4、DYRK2的过表达抑制了5-FUR LoVo细胞的5-FU抗性、增殖、迁移、侵袭和凋亡抗性
为了直接检测DYRK2调控5-FUR LoVo细胞恶性的能力，作者接下来将DYRK2过表达的慢病毒载体或空白对照载体转染入这些细胞中，qPCR和Western blotting证实，DYRK2在这些细胞中成功过表达。CCK-8检测表明，DYRK2的过表达与细胞活力受损有关。此外，DYRK2的过表达显著提高了24 小时内细胞对5-FU处理的敏感性，LoVo 5-FUR NC、LoVo 5-FUR Vector和LoVo 5-FUR DYRK2的IC50分别为：10.280 μg/mL、9.557 μg/mL和3.863 μg/mL。Transwell实验表明，DYRK2的过表达还会诱导细胞的凋亡性死亡，同时损害它们的迁移和侵袭能力。这些结果与DYRK2在结直肠癌中的抑癌基因功能一致。
5、DYRK2的过表达可恢复5-FUR LoVo细胞的上皮表型
如下图所示，免疫荧光染色检测了E-cadherin和Vimentin在这些细胞中的表达。Western blotting结果显示，DYRK2的过表达导致EMT诱导功能受损，Vimentin下调，E-cadherin上调。
6、Twist是DYRK2在结直肠癌中的下游靶基因
为了进一步探究DYRK2与结直肠癌细胞中EMT诱导之间的机制联系，作者检测了DYRK2表达上调后，Twist、ZEB1和Snail的表达水平。结果表明，Snail和ZEB1在三组间无显著性差异表达，而Twist在LoVo5-FUR NC组和LoVo5-FUR Vector组高表达，在LoVo5-FUR DYRK2组表达水平相对较低。
在DYRK2过表达后，Twist在5-FUR LoVo细胞中的蛋白水平降低，因此，Twist可能是DYRK2的底物。为了测试DYRK2调控Twist泛素化的能力，作者将Twist与泛素共孵育，发现DYRK2促进了Twist的泛素修饰。接下来，作者将蛋白酶体抑制剂：MG132添加到细胞裂解液中，进一步确认调控Twist降解的机制。结果显示，在DYRK2存在时，Twist的蛋白水平迅速下降，而在加入MG132处理后，这些水平趋于稳定。这些数据表明，DYRK2可以与Twist相互作用，从而促进其蛋白酶体降解。
7、DYRK2的过表达抑制了体内Twist的表达和结直肠癌异种移植瘤的生长
接下来，作者进行了动物模型实验，结果显示，DYRK2的过表达可以显著降低肿瘤体积和重量，抑制肿瘤生长。治疗3周后，对小鼠实施安乐死，并计算肿瘤抑制率，结果显示，5-FUR LoVo组的肿瘤生长速度明显快于LoVo组(p=0.024)，证实了在体外所观察到的这些化疗耐受细胞的恶性程度增强。5-FUR LoVo组的裸鼠经5-FU处理后，肿瘤生长减慢，肿瘤抑制率为41.39%。5-FUR LoVo vector/5-FU组的抑制率为46.16%，而5-FUR LoVo DYRK2/5-FU组的抑制率显著提高至64.32% (p=0.027)。这些结果证实，DYRK2能够显著增强5-FUR LoVo细胞的化疗敏感性。
相对于LoVo组，在5-FUR LoVo组的肿瘤中，DYRK2的表达水平较低，Twist的表达水平较高，并伴有E-cadherin的表达降低和Vimentin的表达增加，这与这些耐药肿瘤中所发生的EMT诱导一致。相对于5-FUR LoVo/5-FU组，DYRK2过表达的5-FUR LoVo组经5-FU处理后，DYRK2上调，Twist下调；E-cadherin上调，Vimentin下调（EMT诱导被抑制）。这些结果提示，DYRK2可能通过靶向Twist而抑制5-FUR LoVo细胞的EMT，从而调节肿瘤生长和化疗耐药。IHC染色进一步证实，与5-FUR LoVo/5-FU组相比，5-FUR LoVo DYRK2/5-FU组的异种移植瘤中，DYRK2和E-Cadherin蛋白水平显著升高。总之，这些数据证实了，DYRK2可以通过抑制Twist的表达调控肿瘤的生长和EMT的诱导。
8、DYRK2和Twist表达的组合在结直肠癌患者中具有预后效用
为了进一步验证DYRK2在结直肠癌病例中与Twist表达的相关性，作者检测了Twist在结直肠癌组织芯片样本中的表达情况。分析表明，Twist在结直肠癌样本中的表达显著增加，而DYRK2的表达较低。统计分析显示，Twist在结直肠癌组织中的表达与DYRK2呈负相关。此外，配对分析表明，DYRK2高表达且Twist低表达的患者的总生存期和无病生存期明显长于DYRK2低表达且Twist高表达的患者。这些结果表明，DYRK2与Twist的联合检测可作为结直肠癌患者临床预后的预测工具。
研究结论
本研究表明，DYRK2是结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的重要调节因子。DYRK2通过抑制Twist的表达，从而调节肿瘤细胞的EMT诱导、化疗敏感性和凋亡。此外，DYRK2可以作为结直肠癌患者的预后生物标志物，是该类癌症的一个新的有前景的治疗靶点。
