卵巢上皮性癌(EOC)是卵巢癌中比较常见的一种类型，是最常见的组织学类型，也是最致命的妇科恶性肿瘤，每年造成184,799人死亡。EOC由于诊断较晚、腹膜转移、复发率高、可获得耐药等原因，预后较差，5年生存率约为30%。因此，挖掘新的治疗靶点和阐明调控肿瘤进展的分子机制，对提高卵巢癌的治疗水平具有重要的临床意义。
R-spondin (RSPO)蛋白家族有4个同源成员，在脊椎动物中进化保守，具有60%的氨基酸序列同源性。所有的RSPO蛋白都包含4个主要功能区：2个相邻的furin-like结构域(FUs)、1个TSP1结构域和1个富含碱性氨基酸的C端区域。RSPO最初被确定为可有效激活Wnt/b-catenin信号通路。机制上，RSPO通过其FUs结构域与三个富含亮氨酸的重复序列G蛋白偶联受体(LGRs)：LGR4、LGR5、LGR6结合。RSPO/LGR相互作用可以中和两种跨膜E3泛素连接酶：ZNRF3和RNF43，从而阻止细胞表面Wnt受体的内化和降解，最终放大Wnt/b-catenin信号。RSPO介导的Wnt/b-catenin信号激活参与了广泛的生物和生理过程，如：细胞增殖、发育、干细胞维持和肿瘤发生。
RSPO2是RSPO家族的重要成员。在人类，RSPO2基因的多态性导致了掌筋膜挛缩症的遗传易感性。RSPO2表达敲除的小鼠表现出严重发育异常，包括：肺发育不全、颅面和肢体发育缺陷。RSPO2通过增强Wnt/b-catenin信号通路，也与头发生长、成骨细胞分化和骨关节炎有关。值得注意的是，RSPO2最近被确认为一种重要的致癌调控因子。RSPO2的重排和融合在多类肿瘤中发生，如：结肠癌、前列腺癌和肝癌。RSPO2介导的Wnt/b-catenin信号通路的激活已被证明能促进多种肿瘤的生长和转移，包括：舌鳞癌、胰腺癌和乳腺癌。但之前的两项研究表明，RSPO2通过独特的LGR5介导的Wnt/b-catenin信号负反馈机制抑制结直肠癌生长，RSPO2介导的非典型Wnt信号抑制也对结肠肿瘤转移有抑制作用。最近的一项研究表明，RSPO2在肝癌中通过抑制MAPK信号通路发挥抑癌作用。综上所述，这些发现表明，RSPO2在肿瘤发生中的作用是复杂的，它的功能可能依赖于癌症的类型、受体的存在和细胞环境。RSPO2信号已被证明对卵母细胞驱动的细胞间通讯和卵泡生长至关重要。此外，RSPO2突变与原发性卵巢功能不全和高级别浆液性卵巢癌患者的生存有关。这些结果提示，RSPO2可能在女性生育、卵泡成熟甚至卵巢癌的发生过程中发挥作用。然而，RSPO2在卵巢癌进展中的生物学功能仍有待研究。
研究路线
研究内容
1、RSPO2在卵巢癌中表达升高
为了确定RSPO2在卵巢癌中的表达情况，作者首先用qRT-PCR检测了多个卵巢癌细胞系中RSPO2的表达。结果表明，RSPO2在肿瘤细胞中的mRNA表达量普遍高于卵巢上皮细胞：IOSE80。接下来，作者通过组织芯片检测卵巢癌样本中RSPO2蛋白的表达。组织芯片包含了30例新诊断为EOC的患者，年龄27-84岁(平均55岁)。对肿瘤和配对癌旁组织标本进行免疫组化分析显示，RSPO2在肿瘤组织中的表达比在正常组织中表达强度高且表达广泛。染色量化结果显示，RSPO2在卵巢肿瘤组织中的表达明显高于配对癌旁组织。此外，对TCGA数据库中卵巢癌队列的数据分析显示，卵巢癌患者的RSPO2高表达与其较低的生存率相关。对另一个卵巢癌数据集(GSE26193)的Kaplan-Meier分析也显示，RSPO2高表达与生存率差之间存在显著相关。这些结果表明，RSPO2在卵巢癌中的表达水平升高，并与患者预后不良有关。
2、RSPO2促进卵巢癌的生长和转移
RSPO2在肿瘤组织中的异常表达促使作者进而研究其在卵巢恶性肿瘤中的作用。基于RSPO2为分泌蛋白的特性，作者首先通过收集G418耐受克隆构建了RSPO2稳定过表达的卵巢癌细胞系。MTT和集落形成检测表明，RSPO2在A2780和OVCAR3肿瘤细胞中的过表达显著增强了它们的生长能力。为了确定RSPO2对肿瘤生长的特异性，作者接下来在两种卵巢癌细胞系中筛选出两种有效靶向RSPO2的siRNA (siRS2-1#和siRS2-2#)，然后使用最有效的干扰序列：siRS2-2#构建慢病毒载体(shRS2)。siRNA和shRNA介导的RSPO2表达敲除均显著降低了A2780和OVCAR3肿瘤细胞的生长。以上结果提示，RSPO2在体外对卵巢癌细胞生长有促进作用。腹膜转移和远端转移是卵巢恶性肿瘤的特征。RSPO2的异常过表达导致A2780和OVCAR3细胞的迁移和侵袭能力增加了4-6倍。RSPO2的过表达也增加了两种卵巢癌细胞系的运动性。而RSPO2的表达敲除则显著抑制了A2780和OVCAR3肿瘤细胞的迁移和侵袭。与RSPO2的体外迁移促进功能一致，RSPO2在原位小鼠模型中的稳定过表达显著促进了卵巢癌细胞的转移定植，包括：转移结节数量、肿瘤大小和肿瘤重量的增加。注射RSPO2过表达细胞的小鼠与对照组小鼠相比，腹水在腹膜腔中积累更多。此外，皮下注射含有shRSPO2的A2780细胞(RSPO2本底表达水平较高)的小鼠肿瘤负荷明显低于注射shNC对照细胞的小鼠。这些结果表明，RSPO2在卵巢癌进展过程中通过促进肿瘤细胞生长和转移发挥致癌基因的作用。
3、RSPO2促进卵巢癌细胞的上皮间充质转化和细胞周期进展
TCGA数据库的GSEA分析和KEGG通路分析表明，与癌细胞的转移特性有关的两个标签：肌动蛋白细胞骨架和粘着斑基因标签，在RSPO2高表达的卵巢肿瘤样本中高度富集。与生物信息学分析结果一致，RSPO2的过表达导致A2780和OVCAR3细胞对细胞外基质组分的黏附增加。在形态学上，RSPO2的过表达促进了大多数卵巢癌细胞从圆形(上皮表型)向梭形(间充质表型)的转变。F-actin染色进一步证实了RSPO2介导的细胞骨架重排，包括：肌动蛋白应力纤维的增加、片状足和丝状伪足形成的增加。由于肌动蛋白细胞骨架的重组和伴随的膜突起的形成是激活上皮间充质转化(EMT)进程中细胞迁移的重要步骤，作者接下来评估了RSPO2对与EMT相关的蛋白标志物的影响。在RSPO2过表达的A2780和OVCAR3细胞中，N-cadherin和fibronectin的表达量增加，而E-cadherin和ZO-1表达量明显降低。此外，RSPO2的过表达可诱导两种细胞系中基质金属蛋白酶(MMPs)，包括MMP2和MMP7的上调。这些数据表明，RSPO2影响了EMT进程和细胞外基质降解，这两者在卵巢癌细胞的侵袭中都起着重要作用。RSPO2的过表达也会引起细胞周期蛋白：cyclin D1和cyclin E1的表达升高。相应的，RSPO2的表达敲除引起了G1期阻滞。这些数据表明，RSPO2参与了细胞周期调控。综上所述，上述结果提示RSPO2通过影响细胞粘附、EMT和细胞周期进展而促进卵巢癌的进展。
4、RSPO2通过激活FAK/Src信号而促进卵巢癌进展
RSPO2通过增强Wnt/b-catenin信号通路，促进多种与肿瘤进展相关的生物学过程。然而，作者最初的实验显示，在A2780和OVCAR3细胞中，RSPO2的过表达或RSPO2重组蛋白的处理并没有明显激活Wnt/b-catenin信号通路。调整RSPO2的表达并没有改变Frizzled 6/7的水平，Frizzled抑制剂：niclosamide也没有消除两种细胞中RSPO2的促瘤作用。为了阐明RSPO2的非Wnt依赖性促进卵巢癌进展的机制，作者通过转录组测序比较了亲代和RSPO2过表达的A2780细胞的基因表达谱。与之前使用TCGA队列的KEGG分析结果相似，差异基因在细胞骨架、粘着斑相关标签中富集。肿瘤生长和细胞存活相关通路，如：MAPK和PI3K/Akt，在RSPO2过表达的A2780细胞中显著富集并上调。与转录组分析结果一致，无论是RSPO2的过表达还是RSPO2重组蛋白的处理，都会增强FAK Tyr397位点(p-FAK)、Src Tyr416位点(p-Src,Y416)、EGFR Tyr1068位点(p-EGFR)和Akt Ser473位点(p-Akt)的磷酸化，但不影响相应蛋白的表达丰度。在RSPO2表达高的异种移植瘤转移灶中，磷酸化FAK/Src/Akt显著增加。相反，p-FAK、p-Src和p-Akt在RSPO2表达缺失的细胞中的水平低于对照细胞。此外，Src和FAK的抑制剂可以抑制RSPO2对卵巢癌细胞增殖和迁移的促进作用。这些结果表明，FAK和Src的激活与RSPO2对卵巢癌进展的促进有关。此外，FAK活性的抑制消除了RSPO2对EMT标志物和MMP7表达的影响，表明其在细胞迁移和侵袭中有关键作用。Src活性的抑制减弱了RSPO2诱导的EGFR/Akt的磷酸化作用，而Akt活性的抑制则大大降低了RSPO2对细胞增殖的促进作用，这表明RSPO2诱导的Src/Akt激活是肿瘤生长的主要原因。综上所述，这些数据表明，RSPO2通过激活FAK/Src信号级联而促进卵巢癌进展。
5、RSPO2通过LGR4受体促进Src的自激活
接下来，作者研究了RSPO2在卵巢癌细胞中激活FAK/Src信号级联的分子机制。RSPOs通常直接与它们的受体LGRs结合，以增强下游的信号通路，作者因而首先检测了RSPO2对LGRs表达的影响。Western blot分析显示，RSPO2的异常过表达或RSPO2蛋白的处理均可增加LGR4的蛋白水平，而对LGR5的蛋白水平无显著影响。在RSPO2高表达的异种移植瘤样本中也证实了LGR4蛋白的表达上调。此外，LGR4在A2780和OVCAR3细胞中的表达敲除显著抑制了RSPO2的促生长作用，并部分削弱了RSPO2诱导的肿瘤细胞迁移。这些结果表明，LGR4的上调在RSPO2促进卵巢癌生长中起着关键作用。RSPO2对两种卵巢癌细胞系中LGR4的mRNA表达水平均无影响。然而，CHX chase实验显示，RSPO2的过表达显著延缓了LGR4蛋白的降解。此外，在A2780和OVCAR3细胞的细胞质中观察到LGR4和LAMP1的共定位很密集，而RSPO2蛋白的处理减弱了这两种蛋白的共定位，并显著增加了LGR4在质膜上的分布。这些结果表明，RSPO2可抑制卵巢癌细胞中LGR4的内吞作用和溶酶体介导的降解。LGR4的提早表达沉默影响了RSPO2对Src/Akt的激活。此外，LGR4的异常过表达增强了A2780和OVCAR3细胞中Src的磷酸化，而同时将LGR4和RSPO2过表达可以进一步对RSPO2或LGR4单独诱导的细胞的Src激活致敏。这些结果表明，LGR4在RSPO2诱导的Src激活中起着关键作用。免疫荧光成像显示，Src在A2780和OVCAR3细胞中弥漫性表达，RSPO2蛋白的处理导致其由胞浆转移至胞膜，这是Src自磷酸化的特点。值得注意的是，在RSPO2处理的细胞质膜上，LGR4和Src的共定位显著增加。这些结果表明，RSPO2可能通过LGR4-Src相互作用促进Src的膜易位和自磷酸化。Co-IP实验显示，RSPO2的异常表达在A2780和OVCAR3细胞中均可以下拉内源性LGR4或Src, 证实了内源性LGR4和Src之间的相互作用。此外，RSPO2蛋白的处理明显提高了LGR4对Src的亲和力。这些结果表明，RSPO2、LGR4和Src可以在质膜上形成复合物，RSPO2通过LGR4介导的Src膜易位而促进Src的自激活。
6、RSPO2通过与整合素受体结合而增强FAK信号
研究结论
在本研究中，作者证实了RSPO2通过促进卵巢癌细胞的生长和转移，在卵巢癌进展中发挥致癌作用。同时，RSPO2在人卵巢癌组织中的蛋白表达水平升高，且与患者的预后不良相关。从机制上讲，作者揭示了RSPO2通过两种方式增强FAK/Src信号级联，从而促进卵巢癌进展。1、RSPO2促进LGR4介导的Src向胞膜移位；2、RSPO2作为配体直接与整合素β3结合，从而增加整合素的稳定性，这两种作用都增强了卵巢癌细胞中FAK和/或Src的自激活，进而促进卵巢癌细胞的生长和转移。作者提出了一种新的非Wnt依赖性机制，阐明了RSPO2对卵巢癌进展的促进作用。
本研究还证明，对RSPO2诱导的FAK/Src激活的药物抑制可以显著影响卵巢癌细胞的生长和迁移，表明RSPO2/FAK/Src轴是一个可药性靶点。鉴于靶向肿瘤源性RSPO2的单克隆抗体可有效抑制包括卵巢肿瘤在内的人源性异种移植瘤(PDX)的生长，作者提出，基于RSPO2的抗体阻断可能是改善RSPO2高表达的卵巢癌患者预后的一种有用的辅助治疗手段。
参考文献
Pan R, Yu Y, Zhu H, et al. RSPO2 promotes progression of ovarian cancer through dual receptor-mediated FAK/Src signaling activation[J]. Iscience, 2022, 25(10): 105184-105184.
