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Pdia4在基质细胞中通过Stat3通路促进肺癌的发展
研究背景

肿瘤是全球范围内人类死亡的主要原因。据2020年统计,全球新增1400万肿瘤确诊病例和1000万肿瘤相关死亡病例。肿瘤由肿瘤细胞和宿主基质细胞组成。肿瘤微环境中的宿主基质细胞在肿瘤发生、发展和转移中起着关键作用。基质细胞具有异质性,包含:肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞、白细胞等。肿瘤的发展和转移在一定程度上是由肿瘤细胞与肿瘤基质的相互作用引起的。基质靶向治疗与肿瘤靶向治疗一样,因其遗传稳定性和普适性而成为肿瘤治疗的一种选择。然而,目前肿瘤基质治疗的靶点很有限。

越来越多的证据表明,肿瘤细胞指导浸润在肿瘤部位的白细胞,以支持肿瘤的生长和生存。例如,肿瘤浸润性树突状细胞、调节性T细胞和髓系来源抑制细胞都参与免疫抑制活动。相反,其他免疫细胞,如:抗原特异性CD8+ CD4+辅助T淋巴细胞或B淋巴细胞,则被肿瘤相关抗原功能性损害。据报道,来自肿瘤细胞和基质细胞的可溶性介质,如:Cxcl1Ccl2Vegf家族、Tgf-β和GM-CSF参与肿瘤的发展。VegfaVegfbVegfc由不同的Vegf基因编码形成,Vegfa, VegfbVegfcVegfr1, Vegfr2Vegfr3的配体。据报道,VegfaVegfc可以抑制T细胞的功能。转录因子Stat3被定义为肿瘤细胞中的致癌基因,Stat3在肿瘤和基质细胞中通过炎症刺激而激活,而致癌基因调控因子是潜在的肿瘤治疗靶点。

鉴于蛋白质稳态的重要性,分子伴侣逐渐在人类健康和疾病中凸显出其重要性。蛋白质二硫键异构酶(Pdis)是一组具有多种功能的伴侣酶,大多数PdisC末端富含酸性氨基酸序列,为内质网定位信号。然而,越来越多的数据表明,除了定位于胞浆(内质网和其他细胞器)外,Pdis还存在于不同类型细胞的细胞核和细胞膜以及血浆中。因此,与其他内质网分子伴侣一样,Pdis除了具有与内质网相关的定位和功能,也具有与之无关的功能和定位。它们与细胞活力/生长、感染、受精、凝血、免疫及肿瘤相关。Pdis在细胞生长中的作用研究较少,其调节细胞生长的机制仍不明确。酵母的遗传学研究表明,Pdi1对细胞活力至关重要。然而,Pdi1和其他4Pdi1在酵母中可能不能功能互换。哺乳动物有21个具有氧化还原酶、二硫异构酶和伴侣活性的Pdi成员。其中,Pdia4具有3CGHC基序,是结构上最大的Pdi。与Pdia1不同,Pdia4的敲除小鼠没有明显的表型,故其不是必需基因。前期研究表明,Pdia4能抑制肿瘤细胞的死亡。然而,在癌症发展过程中,Pdia4在基质细胞(即宿主Pdia4)中的作用未知


研究路线


研究内容

1、Pdia4在肿瘤基质中过表达且与肺癌患者的生存率呈负相关

作者首先研究了Pdia4在人临床肺癌样本中的表达水平。PrognoScan RNA数据库分析表明,Pdia4 RNA高表达(Pdia4hi)患者的生存率远低于Pdia4 RNA(Pdia4lo)低表达患者。同时,Pdia4hi患者和Pdia4lo患者的中位生存时间分别为62周和大于100周,这对于肺癌治疗具有临床意义。总之,Pdia4在肺癌组织中的RNA表达水平与患者的生存率和中位生存时间呈负相关。接下来,作者使用组织芯片检测了Pdia4在人肺癌肿瘤细胞和基质细胞中的表达水平。结果显示,Pdia4在正常组织中表达水平较低,而在肺癌组织中,无论基质细胞比例如何,Pdia4均表达上调。作者用CD45抗体对基质白细胞染色,以区分Pdia4在肿瘤和基质种的表达。结果表明,Pdia4和CD45在肺癌组织中的表达均高于正常组织中的表达;共定位分析表明,Pdia4在人肺癌的CD45+基质白细胞中的表达更高。同时,作者对Pdia4在小鼠模型和细胞系中的表达水平进行了检测。结果表明,Pdia4在非荷瘤小鼠分离的皮下基质细胞中的表达低于培养的GK1细胞(肺癌细胞);Pdia4在荷瘤小鼠的肿瘤细胞中的表达高于荷瘤小鼠的基质细胞。作者使用抗体阵列检测了96种细胞因子和血清蛋白在GK1细胞的肿瘤条件培养基(TCM)中的表达水平。结果表明,Cxcl1、Ccl2、Spp1、Igfbp6和Mmp3的表达丰度高于其他蛋白。为了解Pdia4表达的调控机制,作者将TCM、Cxcl1、Ccl2以及Cxcl1和Ccl2的组合与脾细胞孵育,共培养24 h后的检测表明,Cxcl1、Ccl2及两者组合诱导的Pdia4水平与TCM相当。然而,这种诱导与细胞增殖和活力的变化无关。


2、宿主Pdia4促进小鼠肺癌和其他类型肿瘤的发展

接下来,作者将GK1细胞皮下注射入野生型(WT)小鼠和Pdia4-/-(KO)型小鼠,构建动物模型研究了Pdia4在肿瘤发展中的功能。结果表明,Pdia4-/-型荷瘤小鼠比WT型荷瘤小鼠的生存率更高。WT型荷瘤小鼠和Pdia4-/-型荷瘤小鼠的中位生存期分别为45天和68天。Pdia4-/-型荷瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量都比WT型荷瘤小鼠小。此外,免疫组化染色数据显示,与WT型荷瘤小鼠相比,Vegfa、Vegfb、Vegfc和磷酸化Stat3在Pdia4-/-型荷瘤小鼠中的蛋白表达水平较低。同时,WT型荷瘤小鼠比Pdia4-/-型荷瘤小鼠有更多的肺转移。同样,B16F10(黑色素瘤细胞)和CT26(结肠癌细胞)的Pdia4-/-型荷瘤小鼠比B16F10和CT26GK1的WT型荷瘤小鼠生存率更高。与WT型荷瘤小鼠相比,Pdia4-/-型荷瘤小鼠的肿瘤体积更小,肿瘤重量更低。这些数据表明,Pdia4对小鼠的肿瘤发展有积极的调控作用。

3、宿主Pdia4影响GK1肺癌荷瘤小鼠基质细胞的数量和功能

作者比较了WT型和Pdia4-/-型荷瘤小鼠的肿瘤基质细胞的组成和功能,以探索Pdia4对基质细胞的影响。流式细胞数据显示,WT型荷瘤小鼠和Pdia4-/-型荷瘤小鼠的基质细胞组成以及GK1细胞数量相似。对基质细胞的分析表明,WT型荷瘤小鼠肿瘤部位的MDSC比例略高于Pdia4-/-型荷瘤小鼠;WT型荷瘤小鼠肿瘤部位的GK1细胞和白细胞数目比Pdia4-/-型荷瘤小鼠多。进一步分析表明,WT型荷瘤小鼠比Pdia4-/-型荷瘤小鼠在肿瘤部位有更多的MDSC细胞、B细胞、T细胞和其他类型的白细胞。此外,WT型荷瘤小鼠比Pdia4-/-型荷瘤小鼠有更多的Treg细胞。然而,两组小鼠的CD4+T细胞和CD8+T细胞比较相似。为了进一步了解Pdia4在肿瘤相关白细胞中的作用,作者分离了肿瘤部位的MDSC、T细胞和B细胞,并检测它们的活性。结果表明,在naive小鼠和αCD3/αCD28激活的脾细胞中,Treg细胞、CD25+FoxP3+细胞的比例分别为5.1%和6%,而MDSC进一步提高了这一比例。从WT型荷瘤小鼠中分离的肿瘤MDSC比从Pdia4-/-型荷瘤小鼠中分离的肿瘤MDSC诱导了更多的Treg细胞。同样,从WT型荷瘤小鼠中分离的脾MDSC比从Pdia4-/-型荷瘤小鼠中分离的脾MDSC诱导了更多的Treg细胞。作者也通过T细胞增殖来检测了MDSC的抑制活性。结果表明,WT型荷瘤小鼠的肿瘤和脾脏MDSC对T细胞增殖的抑制程度大于Pdia4-/-型荷瘤小鼠的肿瘤和脾脏MDSC。此外,WT型荷瘤小鼠的肿瘤T细胞和B细胞比Pdia4-/-型荷瘤小鼠中的增殖减少。同样,WT型荷瘤小鼠的脾B细胞和T细胞的增殖能力低于Pdia4-/-型荷瘤小鼠。这些功能研究表明,Pdia4促进MDSC介导的Treg形成和MDSC活性,并抑制B细胞和T细胞的活性。然而,WT型荷瘤小鼠和Pdia4-/-型荷瘤小鼠的骨髓、胸腺和脾脏的细胞亚群组成没有差异。WT型荷瘤小鼠和Pdia4-/-型荷瘤小鼠的骨髓细胞中Sdf-1及其趋化因子受体Cxcr4的表达水平无差异。WT型荷瘤小鼠与Pdia4-/-型荷瘤小鼠的脾B细胞和T细胞增殖无显著差异。这些数据表明,Pdia4增加了基质白细胞的数量和它们的瘤突能力。

4、T细胞和B细胞是宿主Pdia4GK1肺癌荷瘤小鼠中调控肿瘤发展所必需的

Rag1的敲除会导致小鼠模型缺乏功能性T、B淋巴细胞,接下来,作者使用Rag1-/-和Rag1-/-Pdia4-/-荷瘤小鼠,研究了Pdia4在T细胞和B细胞参与的肿瘤发展中的功能。通过检测生存率、肿瘤体积和肿瘤重量,作者发现Rag1-/-和Rag1-/-Pdia4-/-荷瘤小鼠之间的肿瘤发展没有差异;同时,磷酸化Stat3、Vegfa、Vegfb和Vegfc的表达在Rag1-/-和Rag1-/-Pdia4-/-荷瘤小鼠之间没有发生改变。此外,GK1细胞和基质细胞的数量和组成在Rag1-/-和Rag1-/-Pdia4-/-荷瘤小鼠之间没有差异。为了确定T和B细胞中的Pdia4是否在GK1肿瘤生长中起主要作用,作者将WT型T和B细胞、Pdia4-/-型T和B细胞植入Rag1-/-荷瘤小鼠体内。结果表明,植入Pdia4-/-型T和B细胞的Rag1-/-荷瘤小鼠比植入WT型T和B细胞的荷瘤小鼠生存率更高。同时,植入Pdia4-/-型T和B细胞的Rag1-/-型荷瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量均小于植入WT型T和B细胞的荷瘤小鼠。这些数据表明,WT型T和B细胞在荷瘤小鼠种比Pdia4-/-型T和B细胞具有更强的免疫抑制作用。总之,B细胞和T细胞对宿主Pdia4介导的肺癌发展非常重要。

5、利用系统生物学方法建立Pdia4Stat3Vegf家族在肿瘤基质中的调控关系

作者使用Affymetrix基因芯片对WT和Pdia4-/-小鼠的肿瘤基质进行了基因表达谱筛查,以挖掘宿主Pdia4对肿瘤发展的可能机制。在34000个基因中,作者选取了信号强度大于200的14151个基因进行进一步分析(GSE179339)。在14151个基因中,有1488个基因在WT与Pdia4-/-基质的表达比值高于2.4,66个基因的表达比值低于0.4。1554个基因的IPA信号通路预测分析表明,14个信号通路的z-score值大于4,其中,由26个候选基因组成的卵巢癌通路的−log p值大于2.6,在14个通路中排名靠前。芯片数据显示,Akt3、Ccnd1、Egfr、Fgfr1、Fzd6、Gja1、Irs1、Mras、Msh2、Msh6、Pa2g4、Pdgfc、Pgf、Pik3r4、Prkar2a、Prkar2b、Ptgs1、Rala、Rras2、Smo、Src、Tcf4、Tcf7l1、Vegfb、Vegfc和Wnt9a在WT基质中的表达水平高于Pdia4-/-基质;而Egfr、Fgfr1、Fzd6、Mras、Pik3r4、Wnt9a在两者之间的表达差异无统计学意义。RT-PCR数据证实,上述20个基因在WT和Pdia4-/-基质间的表达水平差异有统计学意义。此外,Vegfa在WT基质中含量高于Pdia4-/-基质,而Stat3在两者间的水平保持不变。蛋白水平的免疫印迹分析显示,Akt3、Ccnd1、Vegfa、Vegfb和Vegfc在WT基质中的表达水平均高于Pdia4-/-基质;磷酸化Stat3在WT基质中的表达水平高于Pdia4-/-基质。然而,Akt3和Stat3在两者间的表达水平只是略有不同。作者接下来集中研究了Pdia4、Stat3和Vegf蛋白在肿瘤基质中的关系。

质谱流式细胞术(CyTOF)接下来检测了Pdia4、Vegfa、Vegfb、Vegfc和磷酸化Stat3在WT和Pdia4 /-荷瘤小鼠的基质亚群中的蛋白水平。结果表明,Pdia4只在WT荷瘤小鼠的基质细胞中表达;磷酸化Stat3、Vegfa、Vegfb和Vegfc在GK1基质细胞和肿瘤细胞中表达差异显著,而Vegfa主要表达于B淋巴细胞。磷酸化Stat3、Vegfa、Vegfb和Vegfc在WT肿瘤基质中的表达水平均高于Pdia4-/-肿瘤基质。这些数据表明,Pdia4、Stat3和Vegf家族在B细胞、T细胞和其他基质细胞中存在调控关系。



6、Pdia4对基质淋巴细胞中Stat3介导的Vegf表达的分子调控

作者检测了Stat3和Pdia4的表达相关性,以探究肿瘤基质中Pdia4对Stat3和Vegf家族的调控机制。双荧光素酶实验表明,Pdia4在Jurkat细胞和Raji细胞中增强了Stat3介导的转录活性,而Pdia4的突变体:Pdia4280-646无法与Stat3结合,在Jurkat细胞中,Pdia4280-646无法增强这种转录。同样,Pdia4和Stat3在Jurkat细胞中的共表达表明,Pdia4与Stat3在体内相互作用;重组Pdia4和Stat3的共孵育表明,Pdia4和Stat3在体外可以直接相互作用。作者还研究了Pdia4在蛋白酶存在时,对Stat3和磷酸化Stat3稳定性的作用。共孵育实验表明,Pdia4可以比牛血清白蛋白更好地抑制胰蛋白酶介导的磷酸化Stat3降解,而Pdia4280-646失去了这种抑制作用。显然,Pdia4的前两个CGHC基序(a.a 1-279)对Stat3的功能很重要。


接下来,为了确定Pdia4和Stat3的相互作用域,作者将全长Stat3(C端有His标记)和Pdia4或Pdia4的缺失/点突变体(N端带有Flag标记)在Jurkat细胞中共表达。免疫共沉淀结果表明,Pdia4的前两个CGHC结构域主要负责其与Stat3的相互作用。此外,当Pdia4的三个CGHC结构域中,CGHC转化为SGHS时,它失去了与Stat3结合的能力。同样的策略被用来确定Pdia4与Stat3相互作用的结合域。结果表明,Stat3的a. a. 1-143 (Stat31-143)对应的N端域是Pdia4的结合域。这些结果表明,Pdia4利用其前两个CGHC结构域与Stat3的N端结构域相互作用。

由于T和B淋巴细胞中的宿主Pdia4对肺癌的发展至关重要,作者接着研究了Pdia4如何调控这两种淋巴细胞中Stat3介导的Vegf家族表达。作者将Pdia4和Stat3表达质粒与Vegf启动子构建的报告基因共转染入Raji细胞和Jurkat细胞,发现Pdia4能够增加Stat3介导的Vegfa、Vegfb和Vegfc基因的转录。有趣的是,Stat3剂量依赖性地增加Pdia4的表达,Cxcl1和Ccl2可以进一步增加其表达。然而,Stat3突变体:Stat3Y750F降低了Cxcl1和Ccl2介导的Pdia4转录。数据表明,Pdia4和Stat3之间存在正反馈关系。功能研究表明,Vegfa、Vegfb和Vegfc破坏了B细胞和T细胞的活化。同时,Matrigel plug试验显示,WT小鼠比Pdia4-/-小鼠有更多的血管生成,Vegfa进一步增大该差异。这项研究证明了,Pdia4在淋巴细胞中调控包括Vegf家族在内的Sta3介导的通路,阐明了Pdia4在肿瘤基质中的作用机制及其作为癌症治疗分子靶点的潜力。

在正常生理条件下,正常肺间质表达无活性的Stat3和基础水平的Pdia4,同样,Vegf蛋白表达也处于基础水平。在肿瘤发生过程中,Cxcl1和Ccl2等致瘤信号诱导Pdia4过表达和Stat3磷酸化,随后导致肺癌基质中Vegf蛋白的上调。结果,Vegf通过诱导抑制性肿瘤微环境(受损的淋巴细胞和抑制性免疫细胞)以及血管生成而促进肿瘤发展。


研究结论

本研究中,作者首次发现Pdia4在肺癌中表达与患者生存期呈负相关;宿主Pdia4在肿瘤发展过程中正向调控基质细胞的数量和免疫抑制功能。机制研究表明,Pdia4通过激活Stat3及其下游通路(如Vegf家族的表达增加),促进肿瘤的发展。

基质细胞中的Pdia4/Stat3/Vegf级联反应有利于肿瘤的发展,同时,肿瘤细胞中的Pdia4/procaspase 3/7通路也对肿瘤的发展有利,故而,作者提出,Pdia4有作为肺癌的肿瘤和基质靶向治疗双靶点的潜力



参考文献

Chen T Y, Yang C Y, Yang M T, et al. Protein disulfide isomerase a4 promotes lung cancer development via the Stat3 pathway in stromal cells[J]. Clinical and Translational Medicine, 2022, 12(2): e606.











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