鼻咽癌(NPC)是发生于鼻咽上皮的常见恶性肿瘤，转移性和侵袭性很强。鼻咽癌在东南亚和中国南部较为常见，其发病率与EB病毒(EBV)感染、基因、种族和环境因素密切相关。目前的治疗方法是放化疗相结合，大大改善了鼻咽癌患者的预后。然而，晚期鼻咽癌患者的5年生存率仍然很低。因此，探索鼻咽癌的发病机制，挖掘新的生物标志物，对寻找适合的治疗策略至关重要。

RNA修饰在恶性肿瘤的发生发展中起着不可或缺的作用。目前，已有超过100种不同类型 RNA修饰的报道。其中，5-甲基胞嘧啶(m5C)是最重要的转录后修饰类型之一，最早发现于tRNA和rRNA中，近期又在mRNA和非编码RNA中发现。与N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰相似，m5C修饰有自己的甲基转移酶“Writer”、去甲基化酶“Eraser”、结合蛋白“Reader”。NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2（NSUN2）是一种m5C甲基转移酶，负责哺乳动物中mRNA的m5C修饰。目前已发表的数据显示，NSUN2在乳腺癌、结直肠癌、胆囊癌等多种肿瘤中过表达，并与肿瘤增殖、迁移等一系列恶性表型相关。NSUN2及其读码蛋白：YBX-1在人膀胱尿路上皮癌(UCB)中高表达，是一种依赖m5C的致癌基因，通过增加肝素结合生长因子(HDGF)的mRNA稳定性来促进人膀胱尿路上皮癌的发生发展。NSUN2通过使p27 mRNA的5 'UTR区域甲基化而抑制p27的表达；NSUN2的过表达可降低p27的表达，增加细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1)的表达水平，从而促进人二倍体成纤维细胞的增殖。NSUN2依赖于m5C介导的甲基化增加TEAD1的表达而促进下咽鳞状细胞癌的细胞增殖和迁移。NSUN2在头颈部肿瘤(HNSC)，包括鼻咽癌在内的鳞状细胞中表达升高。一项研究显示，NSUN2的表达与T细胞活化呈负相关，其表达水平可能作为头颈部肿瘤的潜在免疫治疗标志物。然而，关于NSUN2在鼻咽癌中的生物学作用鲜有报道。

研究路线

1、鼻咽癌中m5C甲基化调节因子的表达谱及其与总生存期的相关性

常见的m5C调节因子包括，8个甲基转移酶：NOP2, NSUN2-7, TRDMT1；1个去甲基化酶：TET2；1个RNA结合蛋白：YBX1。为了研究m5C调节因子在鼻咽癌组织中是否存在异常表达，作者分析了三个GEO数据集：GSE53819，含18个鼻咽癌组织和18个正常组织；GSE12452，含31个鼻咽癌组织和10个正常组织以及GSE61218。分析表明，在三个数据集中，与正常组织相比，NOP2、NSUN2和YBX1在鼻咽癌组织中显著上调。因此，作者选择NOP2、NSUN2和YBX1并利用GSE102349数据集数据进行了生存分析。分析表明，NOP2和NSUN2与无进展生存期相关；NOP2和NSUN2的表达水平高预示着鼻咽癌患者的预后不良。综上所述，m5C调节因子：甲基转移酶在鼻咽癌中表达异常，NOP2和NSUN2的表达水平可以预测鼻咽癌患者的预后不良。考虑到NSUN2是哺乳动物中mRNA m5C修饰的主要甲基转移酶，作者选择了NSUN2进行下一步研究。

2、NSUN2是预测鼻咽癌患者的肿瘤分期、转移及预后不良的生物标志物

为了探讨NSUN2在鼻咽癌发生、发展中的作用，作者通过免疫组化检测了NSUN2在组织芯片（包含125例鼻咽癌患者）中的表达。结果显示，NSUN2主要表达于鼻咽癌细胞的细胞核，这与NSUN2在其他肿瘤细胞中的定位一致。根据染色强度，作者将这些患者分为NSUN2高表达组(n=40)和NSUN2低表达组(n=85)。NSUN2的表达水平与鼻咽癌临床病理特征的相关性分析显示，NSUN2的表达水平与性别(P=0.873)、年龄(P=0.293)、肿瘤大小(P=0.103)无关，而与TNM分期(P=0.001)、远端转移(P<0.001)、复发( P<0.001) 显著相关。这表明，NSUN2可能是一个预测鼻咽癌进展的精准生物标志物。Kaplan-Meier生存分析显示，NSUN2高表达患者的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)均较差。单因素和多因素Cox分析显示，NSUN2是鼻咽癌患者的总生存期(P=0.001,HR=3.993,95% CI=1.721-9.263)和无病生存期(P<0.003,HR=2.538,95% CI=1.384-4.652)的独立危险因素。综上所述，这些结果表明，NSUN2与鼻咽癌的恶性进展密切相关，是鼻咽癌患者预后不良的关键因素。

3、NSUN2促进鼻咽癌细胞的体外增殖

为了进一步研究NSUN2在鼻咽癌发展过程中的潜在生物学作用，作者在两个鼻咽癌细胞系：C666-1和CNE中，通过siRNA使NSUN2表达敲除，或通过pcDNA3.1(+)/NSUN2-HA质粒使NSUN2过表达。验证结果表明，NSUN2在转染后的两种鼻咽癌细胞系中均显著下调或上调。CCK-8结果显示，NSUN2的表达敲除可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖，NSUN2的过表达可促进鼻咽癌细胞的增殖。此外，集落形成实验检测了NUSN2对鼻咽癌细胞增殖的长期影响。结果表明，NSUN2过表达后形成的集落较多，而NSUN2表达敲除后形成的集落较少。综上所述，NSUN2可促进鼻咽癌细胞的体外增殖。

4、NSUN2促进了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭

由于NSUN2的表达水平与鼻咽癌的TNM分期及远端转移密切相关，作者推测NSUN2可能显著影响鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力。transwell实验表明，NSUN2在C666-1细胞中表达敲除后，迁移的细胞数量减少，细胞的侵袭性显著降低。相反，NSUN2的过表达可增加迁移的细胞数量，促进鼻咽癌细胞侵袭。另外，在CNE细胞系中也观察到了类似的结果。这些结果表明，NSUN2能促进鼻咽癌细胞在体外的迁移和侵袭。

5、NSUN2具有负向调控肿瘤微环境中免疫细胞浸润的潜能

为进一步探讨NSUN2在鼻咽癌中的致癌机制，作者将GSE102349中的88例患者分为NSUN2低表达组(n=61)和NSUN2高表达组(n=27)，并对两组样本进行转录组比较分析。分析表明，共有519个基因表达上调，812个基因表达下调(logFC≥0.5且adj.P <0.05)。上调最显著的基因为：NSUN2、TRIP13、CCT5、TOMM40和LSM4，下调最显著的基因为：CALCOCO1、TXNIP、RASA3、SERPINF1和KCTD12。此外，将1331个差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析，结果显示，NSUN2高、低表达组之间的差异表达基因主要富集于：免疫应答（即T细胞活化）、淋巴细胞和单核细胞分化、多种免疫细胞增殖等。KEGG富集分析显示，差异基因主要富集于：细胞粘附分子、趋化因子信号通路、细胞周期和T细胞受体信号通路。

以上结果提示，NSUN2的表达水平可能影响鼻咽癌肿瘤微环境的细胞浸润。因此，作者首先通过ESTIMATE算法评估了鼻咽癌的免疫评分和基质评分，发现两组之间的免疫评分和基质评分存在显著差异。NSUN2表达水平高的鼻咽癌组织免疫评分和基质评分较低。接下来，作者分析了免疫浸润，并表征了两组之间的免疫景观。采用MCP-counter和ssGSEA算法计算了鼻咽癌患者16种免疫相关细胞的丰度。结果表明，NSUN2表达水平高的患者有12个免疫细胞群(T细胞、CD8 T细胞、细胞毒性淋巴细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞系、髓样树突状细胞、中性粒细胞、内皮细胞、成纤维细胞、Tcm和Tem)的丰度较低，而Th2细胞的丰度较高。考虑到NSUN2高表达组和低表达组之间的显著差异，作者进一步研究了NSUN2的表达水平是否影响免疫检查点基因。结果表明，NSUN2高表达组鼻咽癌患者的7个免疫检查点基因：CD4、CXCR4、PDCD1、CD247、PDCD1LG2、CTLA4、TLR9的表达水平低于NSUN2低表达组。此外，作者发现大多数人类白细胞抗原(HLA)基因在NSUN2低表达组有较高的表达水平，这表明，NSUN2的表达水平与鼻咽癌患者的免疫治疗疗效之间存在潜在的联系。此外，作者使用pRRophetic包分析了GSE102349数据集中NSUN2高、低表达组鼻咽癌患者的化疗效果。结果表明，55种化疗药物的IC50在两组间存在显著差异，与NSUN2高表达组相比，NSUN2低表达组患者对大部分化疗药物更敏感。目前，顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇是临床治疗鼻咽癌的一线化疗药物。此外，有研究发现，新的化疗药物如：曲美替尼、多西他赛、奥沙利铂等能够抑制鼻咽癌细胞的生长，为鼻咽癌患者的临床治疗提供了实验依据。作者对不同NSUN2表达水平的鼻咽癌细胞进行了体外药敏试验，结果显示，NSUN2高表达水平的细胞对奥沙利铂的耐药性高于NSUN2低表达水平的细胞。这些结果表明，NSUN2有可能负向调控肿瘤微环境中的免疫细胞浸润，并与化疗耐药密切相关。