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SERCA2的高表达引发肿瘤细胞自噬,是三阴性乳腺癌治疗的一个可药性靶点

研究背景

自噬是一把“双刃剑”,具有抑制肿瘤和促进肿瘤的双重功能,这主要取决于肿瘤发生的背景。尽管自噬在肿瘤发生前被认为具有抗肿瘤潜能,但它经常转变为促瘤机制,使肿瘤细胞得以生存,并在癌症晚期对化疗和放疗“执行”的致命攻击给予抵抗。因此,许多类型的恶性癌症表现出较高的自噬活性。乳腺癌是一种以自噬调节紊乱为特征的恶性肿瘤。近期研究表明,在乳腺癌中,自噬相关标志物LC3在最具侵袭性表型的三阴性乳腺癌中表达最高。在三阴性乳腺癌中,LC3B的高表达与肿瘤进展和不良预后相关,表明其基础自噬及促癌功能的激活。三阴性乳腺癌患者主要依赖于化疗,化疗耐受是其治疗的主要障碍。然而,三阴性乳腺癌维持强大的自噬活性进而导致化疗耐受的机制,以及这种持续的自噬是否可以成功靶向治疗仍有待阐明。

肌质-内质网钙离子ATP酶(SERCAs)作为Ca2+-ATP酶,将Ca2+从细胞质转移到肌质/内质网(ER)的管腔。SERCA依赖性钙转运是内质网中唯一的钙吸收机制。SERCA表达水平在肿瘤发生过程中发生显著变化。作者的团队和同事已经报道了SERCA2(SERCA的一种亚型,也称ATP2A2)的高表达,与不同类型肿瘤的恶性程度密切相关。


研究路线

研究内容

1、SERCA2的表达与三阴性乳腺癌的进展相关并诱导化疗耐受

作者首先检测了SERCA2在三阴性乳腺癌组织芯片中的蛋白表达。不同分期的三阴性乳腺癌患者肿瘤组织的免疫组化分析显示,SERCA2的表达升高与恶性程度相关。作者分析了77例三阴性乳腺癌患者的SERCA2的表达水平与生存率之间的关系,发现SERCA2的高表达与三阴性乳腺癌患者的不良预后相关。此外,在多种三阴性乳腺癌细胞系,包括MDA-MB-231SUM1315MDA-MB-468中,SERCA2的过表达增加了克隆形成的能力。划痕实验显示,SERCA2的过表达促进SUM1315细胞的迁移。相反,SERCA2的表达沉默可以减少这三个三阴性乳腺癌细胞系的克隆形成,并抑制SUM1315细胞的细胞迁移。化疗耐药是三阴性乳腺癌患者治疗的主要障碍,作者评估了SERCA2在药物敏感性中的作用。值得注意的是,SERCA2的过表达显著降低了三阴性乳腺癌细胞对标准化疗药物,包括:紫杉醇(PTX)、卡铂和5-氟尿嘧啶的敏感性。相反,SERCA2的表达沉默增强了三阴性乳腺癌细胞的化疗敏感性。p53是化疗耐受的一个重要成员,而且p53突变在三阴性乳腺癌细胞中频繁发生,作者检测了SERCA2的表达对luminal型乳腺癌细胞(野生型p53)ZR75-1MCF-7的影响,以排除突变型p53SERCA2介导的化疗耐药中的关联。与多个p53突变的三阴性乳腺癌细胞系的结果一致,SERCA2的过表达增加了ZR75-1MCF-7细胞的克隆形成,并且SERCA2的表达水平决定了它们的化疗敏感性。总之,作者的数据提示,SERCA2可能对三阴性乳腺癌的进展和化疗耐药至关重要。




2、SERCA2在三阴性乳腺癌中通过与LC3B相互作用而调控自噬活性

为了确定SERCA2调控三阴性乳腺癌进展和化疗耐受的机制,作者对ATP2A2highATP2A2low乳腺癌进行了基因富集分析。作者的分析表明,自噬相关基因在ATP2A2high肿瘤中表达增加。同样的,与对照细胞相比,SERCA2过表达的SUM1315细胞在EBSS饥饿诱导后,p62降解和LC3B脂化明显增强。自噬抑制剂:巴弗洛霉素A1 (Baf A1)的加入可以抑制自噬流的变化。当雷帕霉素(rapamycin)诱导细胞自噬时,SERCA2的过表达增强了p62的降解和LC3B的脂化。这种自噬流的变化也被Baf A1所抑制。相反,在EBSS饥饿诱导或rapamycin处理下,SERCA2表达沉默的SUM1315细胞的自噬流不受影响。通过将mCherry-EGFP-LC3质粒转染入SERCA2过表达或SERCA2表达沉默的SUM1315细胞,作者进一步检测了自噬小体的形成和LC3的转化。基础条件下,在SERCA2过表达的细胞中比对照组或SERCA2表达沉默的细胞中观察到更多的mCherry阳性和EGFP阴性的斑点,mCherry在酸性环境中有更高的稳定性,这表明SERCA2过表达细胞的基础自噬活性更高。EBSS饥饿诱导后,与对照组相比,SERCA2过表达细胞的LC3点和mCherry-LC3点的数量增加更为明显,而在SERCA2表达沉默的细胞中只观察到少量的mCherry-LC3点。同样,透射电子显微镜证实,在基础条件下,SERCA2过表达的SUM1315细胞中自噬溶酶体比对照组更丰富,这种效应在EBSS饥饿诱导时更为突出。相反,基础或饥饿诱导条件下,在SERCA2表达沉默的细胞中检测到的自噬溶酶体的积累可以忽略不计。此外,SERCA2的短暂过表达显著降低了EBSS饥饿诱导时内质网和线粒体的量,而Baf A1的添加逆转了这一现象。在基础或饥饿诱导条件下,SERCA2过表达也会导致SUM1315细胞线粒体膜电位的显著下降。这些数据表明,SERCA2可以通过自噬诱导内质网(ER-phagy)和线粒体(mitophagy)的清除。此外,Baf A1和ATG5或ATG7的siRNA干扰处理后,药理或遗传学的自噬抑制逆转了SERCA2过表达的SUM1315细胞对PTX的不敏感性。

由于SERCA2是内质网驻留跨膜蛋白,并可能参与选择性自噬,作者假设SERCA2可能是一个自噬受体。生物信息学分析显示,在SERCA家族成员(-EFDEL-)中存在一个保守的LC3结合区域(LIR)基序。GST-LC3B融合蛋白可以特异性地从HEK293T细胞裂解物中下拉FLAG-SERCA2,GST和GST-TRAF6融合蛋白均无法下拉。免疫沉淀(IP)实验证实,内源性和过表达的SERCA2与LC3相互作用,外源性的LC3可以与细胞裂解液中的SERCA2共沉淀。SERCA1和SERCA3也得到了类似的结果。用丙氨酸残基替换LIR基序中的氨基酸(EFDEL/AAAAA, mutLIR)完全消除了SERCA2与LC3的相互作用。此外,免疫荧光分析证实,在EBSS饥饿诱导后,SERCA2与LC3B的共定位增加,而SERCA2与突变LIR则不发生这种情况。在基础条件下,LIR-mutant SERCA2/LC3B双阳性灶(foci)的细胞数量远远低于野生型SERCA2/LC3B双阳性灶的细胞,这表明通过LIR基序的SERCA2/LC3B相互作用导致了SERCA2过表达细胞的高基础自噬活性。LIR突变的SERCA2在EBSS饥饿诱导后未能进一步增强自噬,与野生型SERCA2对照相比,p62降解减少较少。这些数据表明,SERCA2和LC3B通过LIR基序直接相互作用,这是SERCA2介导的自噬所必需的。

3、SERCA2-LC3B相互作用促进了不依赖WIPI2的自噬小体的形成
接下来,作者研究了SERCA2在自噬途径中发挥作用的环节。自噬囊泡成核是自噬小体形成的初始过程,在此过程中,自噬蛋白,如:ULK1/FIP200复合体,定位于内质网上并触发富含磷脂酰肌醇的内质网亚区的形成,这些亚区被称为“omegasome”,定位于内质网的PI3P结合蛋白:DFCP1是其标志物。Co-IP实验表明,过表达的SERCA2可以与ULK1复合物的所有成员:ULK1、FIP200、ATG13和ATG101相互作用。此外,外源表达的SERCA2可在自噬开始时以少量灶(foci)的形式被检测到。DFCP1与SERCA2的强共定位被观察到,这表明SERCA2可能参与了omegasome的形成。在哺乳动物细胞中,omegasome作为吞噬泡扩张的平台,与隔离膜(IM,可被LC3标记)相关。作者发现,一个由内源性LC3B和ULK1复合物成员组成的免疫共沉淀复合物在SERCA2过表达时大量存在,而在LIR-mutant SERCA2过表达时其水平显著降低。由于WIPI2与omegasome和IM相关,并且是自噬体的形成所必需的,作者使用siRNA对WIPI2进行表达沉默以确定SERCA2的作用。WIPI2的表达敲除大大降低了饥饿细胞中p62的降解率,然而,SERCA2的过表达逆转了这一过程。mCherry-EGFP-LC3报告基因还显示,在饥饿诱导下的WIPI2表达沉默细胞中,同时将SERCA2过表达可以恢复LC3的降解。此外,在饥饿对照细胞中,LC3与FIP200的共定位更多。SERCA2或WIPI2的表达沉默均可使LC3与FIP200的共定位减少。然而,在WIPI2表达沉默的细胞中,SERCA2的同时过表达导致了LC3与FIP200的共定位恢复,这表明除了WIPI2, SERCA2还可以通过与ULK/FIP200复合物和LC3B的相互作用,作为omegasome与IM连接的替代桥梁。随着自噬体的靠近,它们与内质网分离。为了排除SERCA2干扰自噬小体成熟后IM-ER分离的可能性,作者使用了thapsigarin (TG),它可以阻止自噬小体与溶酶体融合。据报道,TG处理的细胞中LC3点状体与内质网密切相关,导致自噬体不能完全闭合。在EBSS饥饿诱导4小时后,尽管存在过表达的SERCA2,但未经TG处理的细胞中DFCP1-LC3的共定位要比TG处理的细胞中弱得多。

4、自噬可以诱导SERCA2基因的表达

为了分析自噬溶酶体形成后SERCA2的命运,作者将mCherry-EGFP-SERCA2质粒转染入SUM1315细胞。与基础条件下培养的细胞相比,饥饿诱导1小时后的细胞中,mCherry阳性和EGFP阴性的点更多。流式细胞分析证实,与LC3相似,EGFP-SERCA2的荧光强度在EBSS饥饿时降低,而mCherry-SERCA2的荧光强度增加。饥饿诱导的EGFP-SERCA2降解可通过Baf A1阻断溶酶体功能而逆转,但蛋白酶体抑制剂MG132不能逆转。这些数据表明,SERCA2通过自噬被溶酶体迅速降解。

尽管有这些发现,但在EBSS饥饿诱导期间,SERCA2的蛋白质和mRNA表达水平在三个三阴性乳腺癌细胞系中均呈时间依赖性增加。作为对照,p62的蛋白水平逐渐下降。SERCA2是一个普遍存在的Ca2+泵。据推测,自噬介导的SERCA2降解会上调细胞质Ca2+水平,进而导致SERCA2反式激活。事实上,特异性Ca2+螯合物:BAPTA完全抑制了SERCA2在EBSS饥饿诱导后的表达增加。内质网应激抑制剂:4-苯基丁酸(4-PBA)和AMPK抑制剂复合物C对SERCA2的上调均无影响,排除了Ca2+相关内质网应激或AMPK信号通路是导致SERCA2上调的可能性。相反,作者发现钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶的激酶(CaMKK)的抑制剂:STO-609消除了饥饿诱导下SERCA2的上调。此前有报道称,在细胞内Ca2+瞬时增加时,CaMKK激活CaMKIV,并使该酶能够磷酸化转录核蛋白,如:cAMP反应元件结合蛋白(CREB)。相应地,CREB-1磷酸化水平升高,在EBSS饥饿诱导4小时后达到峰值。STO-609在饥饿诱导下抑制了CREB-1的磷酸化。为了研究磷酸化的CREB-1是否能反式激活SERCA2,作者对ATP2A2基因进行了序列分析。在ATP2A2基因的启动子区域,有一个CREB-1结合位点。CREB-1抗体的ChIP实验显示,EBSS的饥饿诱导显著增强了CREB-1对ATP2A2启动子区域的招募。此外,CREB-1的表达沉默抑制了EBSS饥饿诱导后SERCA2的mRNA和蛋白表达水平的增加。当作者使用放线菌素D阻断转录时,SERCA2在EBSS饥饿诱导下的表达上调也被抑制。这些数据表明,由于SERCA2的自噬降解,细胞内Ca2+的短暂增加,提供了一个“CaMKK-CaMKIV-CREB-1轴”反馈,可能阐明晚期三阴性乳腺癌患者维持高水平SERCA2的原因。


5、小分子RL71是一种新型的SERCA2-LC3B相互作用增强子

为了检测与三阴性乳腺癌的进展和化疗耐药相关的SERCA2表达增加,是否为三阴性乳腺癌治疗的一个可药性靶点,作者寻求高水平靶向SERCA2的有效小分子。作者之前的研究表明,RL71(第二代姜黄素类似物)靶向SERCA2并诱导三阴性乳腺癌细胞的过度自噬性细胞死亡。co-IP实验显示,RL71增强了内源性和外源性SERCA2与LC3B的相互作用,而LC3的交互免疫沉淀证实了在RL71存在时,SERCA2与LC3的结合增强。在MDA-MB-231细胞中,RL71对SERCA2的mRNA或蛋白表达水平均无影响。进一步,作者发现RL71的处理以时间依赖的方式,增强了转染入野生型SERCA2的SUM1315细胞的p62降解和LC3B脂化,而RL71未能影响转染携带突变体LIR的SERCA2的细胞的自噬流,这表明LIR基序对RL71诱导的自噬至关重要。为了探索RL71增强SERCA2-LC3相互作用的模式,作者在4-PBA或BAPTA处理的同时,用RL71处理SUM1315细胞;结果表明,这两种抑制剂对相互作用都没有影响,排除了Ca2+相关信号参与的可能。RL71在内质网管腔侧的一个裂口以E2状态直接与SERCA2结合,而Lys876和His278对其特异性结合至关重要。接下来,作者研究了携带His278A和Lys876A突变的SERCA2对其与LC3B相互作用的影响。结果表明,突变显著破坏了SERCA2与LC3B的结合,这意味着与RL71结合后SERCA2构象的改变可能影响SERCA2–LC3的相互作用。因此,作者进行了分子动力学模拟,发现RL71的结合诱导了SERCA2从E1态到E2态的构象变化,同时,三个细胞质域(N、P和A域)聚集形成一个单一的头状结构。LIR基序位于细胞质的P结构域。E2态下的头状结构降低了SERCA2的灵活性,以最低的自由能促进与LC3的稳定结合(-29.71至-8.33kcal/mol)。这些发现表明,小分子RL71可以作为一种新型的自噬诱导因子,通过直接与SERCA2结合而增强SERCA2–LC3B的相互作用。


6、SERCA2的表达增加使三阴性乳腺癌细胞倾向于RL71诱导的自噬性细胞死亡

接下来,作者检测了RL71对表达不同水平SERCA2SUM1315细胞的细胞毒性效应。SERCA2的过表达使细胞对RL71更敏感,而SERCA2的表达沉默则削弱了这种效应。这一发现与上述标准化疗药物的反应形成了极大的对比。当与Baf A1联合使用时,无论SERCA2表达水平如何,RL71诱导的细胞死亡显著降低,SERCA2中的LIR突变降低了对RL71的敏感性,这表明RL71诱导自噬性细胞死亡依赖于SERCA2-LC3相互作用。此外,Western blotting显示,RL71处理后,SERCA2过表达的细胞中LC3B脂化和p62降解比对照组更明显。相反,在SERCA2表达沉默的情况下,没有观察到自噬流的变化。此外,co-IP实验表明,RL71增强了LC3与几种细胞器特异性蛋白的相互作用,包括:线粒体标志物Cox4ER标志物calnexin和核膜蛋白lamin B1。免疫荧光分析证实,在RL71处理时,LC3ER trackerMitoTracker共定位升高。这些数据表明,RL71可以通过SERCA2-LC3相互作用促进细胞器或其片段向自噬溶酶体的传递,并促进其溶酶体降解,最终导致过度的自噬性细胞死亡。



研究结论

作者报道了SERCA2的表达与三阴性乳腺癌患者的进展相关,它促进了三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和化疗耐药。机制上,SERCA2通过LIR基序与LC3B相互作用,促进不依赖WIPI2的自噬小体的形成,从而诱导自噬。自噬介导的SERCA2降解通过Ca2+/CaMKK/CREB-1回馈诱导SERCA2反式激活。此外,作者发现靶向SERCA2的小分子RL71增强了SERCA2-LC3B的相互作用,诱导细胞过度自噬死亡。在体外和体内,SERCA2表达的增加使三阴性乳腺癌细胞更易发生RL71诱导的自噬性细胞死亡。本研究阐明了三阴性乳腺癌细胞维持高自噬活性以诱导化疗耐药的机制,并提示SERCA2表达增加是三阴性乳腺癌的可药性靶点。




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