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肿瘤微环境中细胞衰老的综合评估

研究背景

癌症被认为是一种老年疾病,是老年人群死亡的主要原因。细胞衰老(CS),被定义为细胞周期的不可逆停滞,是衰老和癌症的一个重要的细胞过程。衰老细胞已在人和小鼠的肿瘤微环境中观察到。目前,越来越多的证据将衰老微环境与癌症的进展和转移联系起来,而在不同类型的癌症中却得出了相互矛盾的结论。衰老细胞的一个特征是促炎趋化因子的分泌增加,这被称为衰老相关分泌表型(SASP)。据报道,SASP通过促进免疫逃逸加速肿瘤生长,但它也可以通过激活不同环境下的免疫应答而阻止肿瘤的发展。因此,研究细胞衰老在不同类型肿瘤中的作用,对特定肿瘤的衰老靶向治疗有重大的意义。

由于缺乏通用和特定的细胞衰老标志物,界定细胞的衰老水平仍然是一个关键的未解问题。衰老细胞的检测主要依靠多种生物标志物的免疫组化(IHC)染色,如SA-β-Galp16INKAp21,以减少观察到的假阳性率。然而,在某些条件下,目前的实验方法无法同时染色。此外,越来越多的研究者关注于,通过整合几种衰老细胞的转录谱从而识别共同的衰老特征,但癌症患者衰老水平的准确量化依旧缺乏特征。因此,迫切需要开发一种量化患者细胞衰老水平的计算方法。

目前的研究主要集中于单癌种或非人类模型,因而将衰老相关机制转化为临床结果仍然具有挑战性。严重的毒副作用和有限的免疫治疗应答使预先识别应答者成为迫切需要。此外,靶向衰老过程被认为是预防癌症和衰老相关疾病的一种有前途的治疗方法。因此,识别具有显著临床相关性的衰老基因将为预后预测和靶点治疗提供潜在的生物标志物。

研究路线


研究内容

1、泛癌水平的衰老相关景观图谱

由于缺乏特异性细胞衰老标志物,作者通过整合多个细胞衰老相关基因来量化衰老水平,进而定义CS评分。作者假定细胞衰老水平越高,与细胞衰老正相关的基因活性和与细胞衰老负相关的基因活性之间的差异越大。因此,作者分三步建立CS评分。作者首先收集了来自164个不同细胞系(总共1259个基因)的细胞衰老基因集,然后应用基因集变异分析(GSVA)算法分别评估个体样本中与细胞衰老正相关基因和负相关基因的活性,最后将这两种活性的差异定义为CS评分。

接下来,作者利用互补的方法评估了CS评分表征衰老状态的可靠性。首先,通过预排序基因集富集分析,细胞衰老正相关基因主要富集于:p53通路、TNF-α通路和干扰素-γ反应通路,这与衰老过程中观察到的炎症和p53活性增强一致。细胞衰老负相关基因主要富集于:DNA修复、G2M检查点、Myc检查点和E2F靶标通路,这与细胞衰老过程中细胞分裂停滞一致。同时,CS评分与致癌基因的表达呈负相关,包括:Myc和E2F的调控基因,而与抑癌基因的表达呈正相关,包括:RB调控基因。这些结果也与当前的观点,即:细胞衰老可由抑癌基因和致癌基因的异常激活而触发一致。接下来,作者测试了CS评分是否可以同实验中广泛使用的衰老标志物(p21和p16INK4A)一样测量衰老水平。和预期一样,作者发现与其他非细胞衰老基因相比,细胞衰老基因与p21和p16INK4A的蛋白表达有显著的相关性。此外,作者发现CS评分能够在15个独立数据集(包括128个细胞系)中区分已知的增殖细胞和衰老细胞,并且其曲线下面积(AUC)高于p21和p16;CS评分与细胞衰老的主要分子特征的相关性也比p21和p16更密切。这些结果表明,CS评分与细胞衰老的主要特征显著相关,与单一细胞衰老标志物(p21或p16)相比有更好的表现。 

接下来,作者使用该方法系统地分析了TCGA数据库中约10000个样本的衰老水平,涵盖了33种肿瘤。不同类型肿瘤的组织特异性衰老水平被揭示。结果表明,来源于泌尿系统、腺体和软组织的肿瘤:前列腺癌、肾透明细胞癌、肾上腺皮质癌和皮肤黑色素瘤的肿瘤细胞具有较高的CS评分。相反,来自生殖器官的肿瘤:睾丸癌、宫颈癌、乳腺癌和卵巢癌的CS评分较低。此外,作者研究了来自基因型组织表达(GTEx)数据库的超过9000个正常样本的衰老水平,并观察到类似的组织特异性分布。细胞衰老分布的一致性趋势表明,组织类型可能是影响肿瘤衰老程度的重要决定因素。此外,原发肿瘤与相邻的癌旁组织相比,CS评分较低,且差异较大,表明肿瘤生长是一个逃离细胞衰老的过程。此外,在泛癌水平上,患者诊断时的年龄与肿瘤微环境的衰老水平略有正相关(coefficient=0.136,P=1.48e−04),但在乳腺癌、肺鳞癌和肺腺癌中表现出更紧密的相关性。这些肿瘤主要源于上皮组织,观察到的显著相关性可以解释上皮癌中呈年龄依赖性的衰老细胞积累。总之,这些结果表明,作者的方法可以稳健地量化衰老水平,并系统地描绘了33种肿瘤和29种正常组织的细胞衰老景观。


2、衰老水平与肿瘤特异性基因组变异有关

基因组不稳定性的增加是癌症和衰老的共同特征;然而,在多种癌症中,基因组的改变如何随衰老而变化仍有待阐明。为了深入了解这一问题,作者探索了衰老水平与拷贝数变异(CNVs)和单核苷酸变异(SNVs)的关系。对于CNV,作者通过GISTIC2.0中focal, arm和染色体水平的总和,以计算CNV评分。通过多元线性回归校正性别、种族、癌症类型和诊断时的年龄,作者发现CS评分和CNV评分之间存在显著负相关(coefficient=-0.81,p<2e−16)。进一步的肿瘤特异性分析显示,在33种肿瘤中,CS评分和CNV评分在其中的20种肿瘤,尤其是前列腺、肝细胞癌和肺腺癌中存在显著相关性。作者还使用非整倍体评分验证了相关性,这是一种测量改变的染色体臂的总数的实验方法。接下来,作者在充足的样本(至少100个样本)评估了不同类型肿瘤患者arm水平CNV的扩增和缺失与CS评分的关系。总的来说,与臂缺失水平相比,臂扩增水平在不同的肿瘤类型中与CS评分相关性更显著。同时,显著的臂水平改变在某些染色体臂相对积累,如前列腺癌患者的8p和8q与CS评分较低显著相关。8p的缺失和8q的扩增是高级别前列腺癌的重要表型,提示低衰老水平可能与更具侵袭性的表型相关。

对于SNVs,作者使用了类似的多元线性回归模型,发现CS评分与较低的总突变数相关(coefficient=−0.18,P<2e−16)。TCGA的数据分析显示,33种肿瘤中有15种的CS评分和突变负荷之间存在显著相关性,其中包括:前列腺癌、乳腺癌和肺腺癌。前列腺癌表现出相对较高的细胞衰老水平,作者进而选择该类肿瘤,分析低CS组和高CS组(以CS评分中位数为界)前列腺癌患者的突变差异。微卫星不稳定性(MSI)是高突变肿瘤中由于错配修复基因缺失而产生的分子特征。低CS组前列腺癌患者的MSI评分也较高。低CS组前列腺癌的每位患者通常都发生了较多的突变。具体而言,作者发现错义SNV是主要的突变事件,尤其是C>T突变。为了确定驱动突变在高CS组和低CS组之间的差异,作者分别筛查了每组的最高突变致癌基因。TP53、SPOP的突变在低CS组前列腺癌患者中更为常见,作者通过实验证实了这一点。此外,CTNNB1突变只发生在低CS组前列腺癌患者中。这些突变与前列腺癌的恶性转化有关,提示低CS患者具有更多的恶性特征。同样,作者在前列腺癌中还发现,CS水平与DNA修复缺陷和肿瘤干性指数显著相关。 

总的来说,CS评分与CNV和SNV的负相关表明,基因组改变在衰老水平低和高侵袭性的肿瘤细胞中比在衰老细胞中发生更频繁,表明肿瘤发生过程比衰老过程发生了更密集的基因组改变。

3、衰老微环境中的肿瘤特异性免疫特征

肿瘤免疫是影响肿瘤生长和患者预后的重要因素。为了研究衰老对肿瘤免疫的影响,作者利用ESTIMATE算法评估了TCGA中所有类型肿瘤的免疫评分(免疫细胞比例)、基质评分(基质细胞比例)和ESTIMATE评分(非肿瘤成分比例)。使用多元线性回归校正癌症类型,作者观察到CS评分与三个评分显著相关。在33种癌症中,作者在其中的24种中观察到CS评分与免疫评分的显著正相关,包括前列腺癌和皮肤黑色素瘤。衰老细胞的特点是释放过多的SASP因子,以促进肿瘤免疫。接下来,作者评估了衰老水平与SASP相关细胞因子的相关性。在大多数类型的癌症中,如:前列腺癌、皮肤黑色素瘤和肺鳞癌,与CS显著相关的SASP细胞因子占比高于所有的免疫相关基因。这一分析表明,SASP诱导的免疫浸润也可能发生在衰老癌症中。为了验证这一假设,作者使用了CIBERSORT算法对肿瘤样本中22个免疫细胞的组成进行去卷积分析。分析表明,在大多数癌症类型中(32种癌症类型中有25种),总免疫细胞的浸润丰度与CS评分显著相关,而特异性免疫细胞的浸润度则以癌症特异性模式变化。例如:促进肿瘤生长的巨噬细胞(M2型)与前列腺癌的CS评分呈负相关,但并非所有癌症类型都是如此。这一结果提示,在前列腺癌患者的衰老癌症中存在免疫激活微环境。

此外,作者确定了与CS评分相关的免疫分子特征。首先,作者识别了关键的细胞衰老相关的免疫检查点受体-配体对相互作用,如:PD1及其配体(PD-L1和PD-L2),以及CTLA及其配体(CD80和CD86)。前列腺癌和皮肤黑色素瘤中,高CS组的PD-L1转录本和蛋白表达增强;CS评分与其他免疫检查点基因的表达(PD1、PD-L2、CD80和CD86)呈正相关。免疫细胞溶解活性(CYT)评分被定义为GZMA和PRF1转录本的平均值,是评估T细胞毒性的一个有价值的指标,也是预测免疫应答的一个生物标志物。接下来,作者观察到,在大约一半的TCGA癌症类型中,衰老肿瘤保持了较高的CYT。作者将PD-L1的蛋白表达和CYT评分相结合,发现在前列腺癌、皮肤黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤等七种肿瘤中的CS评分与两者均呈正相关。作者猜测,在相对衰老的微环境中,由于PD-L1表达的升高和足够的溶细胞性T细胞,这类肿瘤更容易接受免疫治疗。

为了验证CS评分与免疫浸润水平和免疫分子特征的相关性,作者在72例前列腺癌患者中进行了p21(一种广泛使用的衰老标志物)、CD45(一种在所有白细胞中表达的常见抗原)和PD-L1的免疫组化染色。结果表明,p21与PD-L1、CD45的表达呈显著正相关。总之,作者的结果揭示了衰老水平与免疫特征的癌症特异性关联,并证明了前列腺癌和皮肤黑色素瘤在相对衰老的微环境中表现出更高的免疫治疗敏感性。

4、单细胞分析表明衰老的异质性和相关的免疫信号

作者使用了10个单细胞数据集,包含来自107例患者的97440个细胞(GSE141445、GSE143423、GSE146771、GSE102130、GSE131928-10X、GSE131928-Smartseq2、GSE117570、GSE143423、GSE118828和GSE72056),检验肿瘤微环境中细胞衰老水平是否存在异质性。应用MAESTRO的标准流程,作者识别了细胞群,并将它们比对到主要细胞谱系中。有趣的是,作者发现不同细胞类型的细胞衰老水平在不同的数据集分布一致。基质细胞(成纤维细胞和内皮细胞)的衰老水平最显著,且其CS评分和基质评分显著相关。相反,恶性细胞表现出相对较低的衰老程度。在免疫细胞中,髓系细胞的CS评分相对高于T细胞。

为了分析肿瘤内细胞衰老异质性对肿瘤微环境的影响,作者进一步分析了来自33100个前列腺癌单细胞数据集(GSE141445)。同样,作者观察到CS评分在前列腺癌微环境中的细胞间异质性。高CS组和低CS组癌细胞中差异表达基因(DEGs)的通路富集显示,衰老癌细胞中免疫相关通路显著富集,包括:抗原递呈、免疫调节作用和干扰素-α/β信号。特别是高CS的癌细胞呈现出更多的人类白细胞抗原(HLAs):B2M、HLA-B和HLA-C,提示衰老癌细胞可以通过在细胞表面呈现更多的自身抗原来促进免疫细胞的识别和清除。这一结果也蕴涵了癌细胞衰老相关调控的潜在细胞内机制。

衰老细胞可以通过改变旁分泌通讯影响局部肿瘤免疫。在探索了衰老癌细胞的细胞内变化之后,作者接下来通过CellPhoneDB分析了细胞与细胞之间的相互作用。作者发现,在高CS和低CS组的癌细胞优先与不同的邻近细胞进行交流。低CS癌细胞与内皮细胞的受体-配体对相互作用更多,包括:CXCL1_ACKR1JAG1_NOTCH3。这些受体-配体对促进肿瘤生长、侵袭和转移。相比之下,高CS癌细胞表现出一种独特的T细胞募集和激活的受体-配体对相互作用模式(CXCL12_CXCR3, CXCL12_CXCR4PLA2G2A_a4b1),而与T细胞抑制因子(MIFTNFRSF14)的相互作用较少。综上所述,衰老癌细胞与免疫细胞之间频繁的免疫刺激交流提示,细胞衰老可能通过细胞间调控提高前列腺癌患者的肿瘤免疫。


5、衰老水平是免疫治疗应答的一个潜在预测指标

衰老背景下的免疫改变启发作者考虑CS评分是否有预测免疫治疗的潜力。由于恶性细胞是肿瘤活检的主要细胞类型,作者首先检测了治疗前后患者的配对恶性细胞(GSE123813和GSE117988,共63032个单细胞)的CS评分的变化。无应答者的恶性细胞CS评分在治疗后显著下降,而ICB(免疫检查点抑制剂治疗)应答者CS评分在治疗后显著升高。接下来,作者通过在线性模型中调整不同患者作为协变量,在更大数据集(总共115853个单细胞)对未配对的ICB治疗患者进行了研究。作者同样观察到,在五个单细胞转录组测序数据集中,应答者的CS评分与治疗正相关,而无应答者负相关。应答者和无应答者在治疗后的细胞衰老水平的变化相反表明,CS评分在预测ICB应答方面具有潜力。

为了深入了解上述细胞衰老水平变化相反的可能机制,作者计算了基底细胞癌(BCC)队列中CS评分与KEGG通路活性之间的相关性。作者在应答者和无应答者之间发现了一系列独特的细胞衰老相关的通路和基因。应答者的衰老细胞与更多的免疫介导信号和基因相关,包括:NFATC1激活的细胞毒性T淋巴细胞。相反,无应答者的衰老细胞与肿瘤发生相关的信号和分子相关,如:在肿瘤细胞中起促生存作用的BIRC3和恶性表型相关的TNFAIP3。需要进一步的研究来解释在ICB治疗中调控细胞衰老相关差异的潜在机制。

此外,作者研究了CS评分在大样本(8个接受ICB治疗的队列,共542名患者)中的预测能力。结果表明,CS评分对ICB应答率具有预测意义,平均AUC0.68。此外,作者应用肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE,一个预测ICB应答的创造性计算方法)工具,TIDE评分在多个ICB队列中的预测效果进行评估,并观察到CS评分在黑色素瘤和肾癌队列中比TIDE评分的AUCs高,与这类癌症中细胞衰老相关的免疫分子改变一致。综上所述,这些结果表明,细胞衰老水平与应答者和无应答者的不同生物学行为有关,具有预测ICB应答的潜力。


6、衰老水平预测前列腺癌患者的主动免疫应答和预后良好

由于上述观察到CS评分与免疫特征存在显著关联,作者假设这些关联可以使CS评分作为预后预测因子。以年龄、性别、种族和癌症类型作为协变量,使用Cox比例风险模型,作者发现,在TCGA中,CS评分较高通常与总生存期(OS,HR=0.92)和无进展生存期(PFS,HR=0.83)的风险降低相关。单癌种的进一步分析表明,前列腺癌患者的高衰老水平与生存期延长相关。肿瘤中丰富的免疫浸润被认为是常规的预后因素,这与前列腺癌中CS评分与总细胞浸润呈正相关一致。

作者接下来选择前列腺癌检测衰老水平对临床指标的影响。分析显示,Gleason评分、T分期和N分期越高的患者CS评分越低,表明衰老肿瘤维持较少的恶性特征。为了进一步证实这一发现,并检验基于CS评分的分组稳健性,作者提取了与细胞衰老相关的所有基因的表达,并进行一致性聚类,将前列腺癌患者分成了两组。无监督分析显示了两个聚类(聚类1和聚类2),聚类2的患者生存率更高。正如预期的那样,聚类2的患者主要来自高CS组,维持的炎症免疫表型(immune C3)高于免疫抑制表型(immune C1和C4)。此外,KEGG数据库中所有免疫通路的分层聚类也显示出与一致性聚类分类相似的分组,表明衰老肿瘤微环境中整体免疫激活。总之,作者的分析表明,CS评分在识别预后良好和主动免疫应答的前列腺癌患者方面具有潜在的预后价值。

7、前列腺癌衰老预测因子的鉴定和验证

为了便于临床应用细胞衰老特征判断预后,作者采用了三种基于机器学习的算法从所有衰老基因中选择关键特征。作者收集了5个共含1159例前列腺癌患者的队列,并将TCGA PRAD队列作为训练数据集,其他作为独立验证数据集。通过LASSO、RFB和XGBoost分别鉴定出10个、3个和21个显著基因。选择三种算法中的三个共同的基因:SPAG5、TACC3、TROAP构建多元Cox回归模型。作者将细胞衰老预测因子定义为:CS预测因子=−0.00358×SPAG5表达−0.0367×TACC3表达−0.0697×TROAP表达。正如预期的那样,在TCGA数据和4个独立队列中,CS预测因子与CS评分显著相关。然后,作者根据CS预测因子的中位数将患者分为高组和低组。在所有五个队列中,CS预测因子较低的患者预后明显较差,疾病进展较快(log-rank p<0.05)。此外,作者评估了CS预测因子在每个队列中的预测能力。CS预测因子在预测1年、3年和5年的无进展生存期中表现优异,在TCGA训练数据集和4个验证数据集中的平均AUC约为0.7。3个基因在不同肿瘤分期中的表达进一步证明了,TCGA PRAD患者肿瘤分级越差,CS预测因子越低。 

为了验证CS预测因子的预测价值,作者选择了72例前列腺癌患者,对SPAG5、TACC3和TROAP进行了免疫组化染色。根据定量结果,作者计算了每例患者的CS预测因子,发现它们与较低的肿瘤分级和Gleason评分显著相关。同时,3个基因的表达也分别存在相关性。综上所述,这些结果表明,CS预测因子与不同队列的前列腺癌患者的临床结果显著相关,表明三个细胞衰老特征核心基因可能是前列腺癌的潜在预后生物标志物。

研究结论

目前,细胞衰老作为肿瘤抑制或肿瘤激活的功能仍然存在争议。本文,作者首次通过整合多个衰老相关基因,并提出肿瘤衰老的统一度量标准—CS评分,可以在泛癌水平进行衰老水平的综合评估。

为了促进衰老评估,作者建立了一个交互式的在线网站:肿瘤细胞衰老评估资源(TCSER,http://tcser.bmicc.org),允许用户评估细胞衰老水平及进行相关分析,并可在用户定制和公开的转录组数据中识别与细胞衰老相关的免疫细胞和分子。

作者的发现为更好地理解肿瘤微环境中细胞衰老的相关调控提供了一个框架,并将推动临床肿瘤学中生物标志物识别和个性化治疗策略的发展。

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