研究背景

黑素瘤是一种侵袭性皮肤肿瘤，5年生存率只有15%-20%，由黑色素细胞逐步发展而成。正常的黑色素细胞通过粘附分子E-cadherin与角化细胞相互作用。在黑色素瘤进展过程中，黑色素瘤细胞通过多种机制从角化细胞中逃逸，包括E-cadherin下调和N-cadherin上调。这种钙粘蛋白转换使黑色素瘤细胞能够直接与真皮的 N-cadherin阳性细胞相互作用，这对这些细胞的转移至关重要。虽然黑色素瘤细胞不是来自上皮细胞，但它们经历了一个类似于上皮间充质转化(EMT)的表型转换过程。例如，EMT诱导剂：TWIST1和ZEB1在黑色素瘤中异常重新激活，并与BRAF致癌基因作用，诱导黑色素细胞的肿瘤转化，促进黑色素瘤的发展。N-cadherin被E-cadherin功能性替换可以在体外抑制黑色素瘤细胞的增殖、运动和侵袭，在体内降低致瘤性。通过分析原发和转移性黑色素瘤基因表达谱的差异，鉴定参与N-cadherin向E-cadherin逆转的分子，将为黑色素瘤的治疗提供潜在的治疗靶点。

膜联蛋白（Annexin）是钙和磷脂结合蛋白的一个超家族，参与许多细胞过程，包括：钙离子信号通路、生长调控、细胞分裂和细胞分化。膜联蛋白的失调与多种人类恶性肿瘤的发生、发展相关。Annexin A10(ANXA10)是最近发现的Annexin家族成员，其在肝癌、胰腺癌、口腔癌和上皮性卵巢癌等恶性肿瘤中异常表达。根据肿瘤类型的不同，ANXA10的表达具有不同的预后价值。ANXA10表达减少与肝细胞癌的血管侵犯、肿瘤进展和预后不良有关；在前列腺癌、胃癌和膀胱癌中，ANXA10表达的降低与细胞增殖和迁移的增加相关；相反，在结直肠癌、口腔鳞癌、头颈部鳞癌，尤其是有转移的患者中，ANXA10的表达上调与预后不良相关。虽然ANXA10参与细胞增殖、分化和细胞骨架组装的调控，但其影响肿瘤进展以及患者预后的分子机制尚不清楚。

研究路线

研究内容

1、ANXA10在黑色素瘤中表达上调且与黑色素瘤的进展相关

作者首先使用Oncomine数据库分析了ANXA10在黑色素瘤中的mRNA表达水平。结果表明，在包含良性黑色素痣(n=18)和皮肤黑色素瘤(n=45)的Talantov黑色素瘤mRNA数据集中，皮肤黑色素瘤中ANXA10的mRNA表达水平显著高于良性黑色素痣。作者接下来使用TIMER数据库分析了ANXA10高表达对黑色素瘤患者生存的临床意义。Kaplan-Meier分析显示，ANXA10的高表达与皮肤黑色素瘤(SKCM)患者的低生存率相关，尤其是原发性皮肤黑色素瘤患者。作者进一步通过免疫组化染色检测了含40个人黑色素瘤组织样本的组织芯片中ANXA10的表达。结果表明，ANXA10在转移性黑色素瘤中表达显著上调，并与黑色素瘤的进展相关，提示ANXA10可能在黑色素瘤中发挥肿瘤促进作用。接下来，作者利用两种小鼠黑色素瘤细胞系：B16F10和B16F1来研究ANXA10的功能，B16F10细胞比B16F1细胞具有更高的转移潜能。与在人类临床样本中观察到的结果相似，ANXA10在B16F10细胞中的表达比在B16F1细胞中高。同时，ANXA10在人黑色素瘤细胞系A375中的表达比人角质形成细胞HaCaT中的表达高。

2、ANXA10提高了黑色素瘤的转移能力

为了进一步研究ANXA10在黑色素瘤进展中的作用，作者建立了ANXA10稳定过表达或敲除的B16F10细胞系。在细胞增殖实验中，与WT细胞相比，ANXA10-KO细胞显示出相似的细胞生长速率。然而，transwell实验表明，ANXA10的过表达显著促进细胞迁移，而ANXA10的表达缺失则显著减少了细胞迁移。在伤口愈合试验中也观察到类似的结果。此外，活细胞成像显示，ANXA10-KO细胞的移动速度比WT细胞慢。此外，ANXA10过表达的B16F1细胞的细胞迁移增强，而 siRNA介导的ANXA10表达抑制则以剂量依赖的方式降低了B16F10细胞的定向迁移，从而进一步证明了ANXA10对细胞运动的重要性。

接下来，作者在体内检测了ANXA10在黑色素瘤转移中的作用。与体外实验结果一致，在小鼠黑色素瘤同种异体移植瘤模型中，ANXA10的表达缺失不影响黑色素瘤的生长，但在小鼠肺转移模型中显著抑制黑色素瘤的转移。与野生型B16F10细胞移植小鼠相比，ANXA10-KO细胞移植小鼠的肺转移结节数量明显减少，而结节大小上没有差异。总的来说，作者的结果表明，在黑色素瘤中，ANXA10与转移有关，但与增殖无关。

3、ANXA10通过TGF-β/SMAD通路诱导E-cadherin和N-cadherin的转化

黑色素瘤细胞通常表现出与转移扩散相关的EMT表型。SMAD依赖的TGF-β信号通路是控制EMT开关的主要途径之一。TGF-β信号引发信号级联，包括SMAD2/3磷酸化、SMAD4核易位和TGF-β/SMAD应答基因的转录激活。为了证实ANXA10是否调节TGF-β/SMAD信号，作者检测了ANXA10表达缺失后TGF-β诱导的细胞内信号转导的变化。TGF-β诱导的SMAD2磷酸化在ANXA10-KO细胞中被抑制。同时，在ANXA10-KO细胞中，TGF-β诱导的SMAD4核易位和TGF-β/SMAD依赖的转录激活均受到抑制。

SMAD6是TGF-β/SMAD信号通路中的抑制型SMAD (I-SMAD)。在ANXA10-KO 细胞中，qRT-PCR检测到SMAD6的mRNA表达上调，而在ANXA10过表达的B16F10细胞中SMAD6表达下调，提示ANXA10对SMAD6有负向调控。重要的是，ANXA10-KO细胞表现出更高的E-cadherin表达和更低的N-cadherin表达，这与SMAD6表达的增加是协调的。在ANXA10-KO细胞中，免疫荧光实验证实了N-cadherin到E-cadherin的表达转化，SMAD6的siRNAs干扰可以使E-cadherin到N-cadherin的开关恢复。因此，ANXA10可能通过下调TGF-β/SMAD信号通路中的SMAD6来促进E-cadherin到N-cadherin的转化。

4、ANXA10通过PKD1信号通路对SMAD6产生影响

此前的一项研究表明，在肺成纤维细胞中，TPA（PKC抑制剂）通过PKD1通路下调SMAD6的表达。PKD1，又名PKCμ，是一种PKC相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被佛波酯激活。作者在B16F10细胞上的实验表明，PKD1的过表达下调了SMAD6的表达；尤其是在ANXA10-KO细胞中，PKD1过表达和TPA处理的联合使用完全抵消了SMAD6的表达升高。有趣的是，作者发现在ANXA10-KO细胞中PKD1的表达水平显著下调。这一发现在用ANXA10的siRNA干扰的B16F10细胞中得到了进一步验证。siRNA干扰对ANXA10的表达抑制选择性地降低了PKD1的表达水平，但没有降低其他PKC亚型的表达水平，而且还诱导了SMAD6表达上调以及N-cadherin到E-cadherin的转化。作者在B16F1和B16F10细胞中进一步检测了ANXA10与PKD1的表达相关性。结果表明，PKD1与ANXA10呈表达正相关，与SMAD6呈表达负相关。与野生型B16F10细胞相比，ANXA10-KO细胞中PKD1的表达水平较低，SMAD6的表达水平随PKD1表达水平的降低而升高。因此，ANXA10对SMAD6的负调控可能依赖于PKD1信号通路。

5、ANXA10通过与PKD1相互作用而调控其降解

为了确定ANXA10在PKD1蛋白水平调控中的作用，作者首先检测了PKD1在ANXA10-KO细胞中的转录表达水平。结果表明，ANXA10的表达缺失不影响PKD1的mRNA表达水平。环己烷(CHX)处理导致了PKD1的快速降解，同时降低了ANXA10的表达水平。MG132处理不仅抑制了PKD1的降解，而且恢复了ANXA10-KO细胞中PKD1蛋白水平的下降。作者同时也发现，ANXA10的过表达以剂量依赖的方式抑制PKD1的多聚泛素化。接下来，作者通过Co-IP实验分析ANXA10与PKD1之间的相互作用。在Flag-PKD1和Myc-ANXA10共转染的293T细胞中，作者通过Co-IP检测证实了PKD1和ANXA10之间的相互作用，并通过免疫荧光检测观察到它们的共定位。为了确定PKD1与ANXA10相互作用的结合域，作者生成了一系列PKD1片段。Co-IP分析显示，Flag-PKD1 (400-551aa和428-748aa)与ANXA10相互作用；这些区段都包含PKD1(428-550aa)区段。Molecular docking预测表明，PKD1与ANXA10的结合位点位于PKD1的α螺旋状区域(500-550aa)，该区域位于PH结构域(400-551aa)内，是PKD1蛋白之间相互作用的表面。作者的数据表明，ANXA10是一种新的PKD1相关蛋白，调节PKD1的降解。

6、ANXA10抑制E3连接酶TRIM41介导的PKD1降解
由于ANXA10和PKD1之间的关联，作者接下来研究了ANXA10调控PKD1降解的机制。为了研究PKD1复合物在B16F10细胞中的交互作用网络，作者将Flag-PKD1过表达，并通过anti-Flag抗体进行免疫沉淀获得了PKD1相关复合物。纯化后的蛋白经酶切后，经LC-MS/MS分析进行蛋白鉴定。通过质谱分析，作者鉴定了两个感兴趣的候选蛋白：TRIM41和TRIM28，它们是三结构域蛋白家族的成员，具有E3连接酶的功能。作者通过siRNA干扰使TRIM41和TRIM28的表达沉默，发现在ANXA10-KO细胞中，TRIM41的siRNA干扰能使PKD1水平恢复，而TRIM28的siRNA干扰则不能。同时，TRIM41的过表达导致PKD1表达水平下降，导致SMAD6表达水平升高。此外，MG132的处理抑制了TRIM41过表达引起的PKD1表达水平下降。与TRIM41作为E3连接酶的功能一致，当TRIM41过表达时，PKD1多聚泛素化水平增加，说明TRIM41是PKD1降解所需的E3连接酶。

作者通过Co-IP实验证明了TRIM41与PKD1相互作用，但当ANXA10过表达时，这种相互作用被PKD1和ANXA10的相互作用所取代。作者推测，ANXA10可能通过与PKD1相互作用来保护PKD1免受TRIM41介导的降解。为了验证这一假设，作者诱导PKD1 (400-551 aa)的表达，使其作为ANXA10-PKD1关联抑制剂，与ANXA10竞争结合。PKD1 (400-551 aa)过表达有效降低了PKD1蛋白水平，TRIM41的siRNA干扰可使PKD1蛋白水平恢复。与ANXA10缺失的效果类似，PKD1 (400-551 aa)过表达导致B16F10细胞中SMAD6水平升高，细胞迁移减少。此外，PKD1 (400-551 aa)过表达部分抑制了TPA诱导的PKD1活性，类似于ANXA10表达缺失的效果。这些结果表明，ANXA10通过与PKD1结合并保护其免受TRIM41介导的泛素化作用而上调PKD1的蛋白水平。

7、ANXA10通过PKD1-SMAD6通路而促进转移潜能

B16F10是一个高转移性黑色素瘤细胞系，细胞呈典型的拉长的间充质样形状。然而，作者观察到在ANXA10-KO和PKD1-KO细胞中，细胞形状都从细长的纺锤形转变为椭圆形。通过肌动蛋白丝的荧光成像清楚地记录了细胞形态的变化。值得注意的是，经过SMAD6的siRNA干扰处理后，ANXA10-KO细胞恢复到拉长的形态，在PKD1过表达时也观察到类似的表型，这是SMAD6下调的一种替代方式。同样，PKD1的过表达和SMAD6的siRNA干扰都增强了ANXA10-KO细胞的定向迁移。与ANXA10-KO细胞类似，PKD1-KO细胞的迁移减少，但可通过SMAD6的siRNA干扰恢复。通过transwell侵袭实验，作者证实了B16F10细胞的侵袭能力受到SMAD6表达水平的密切调控。SMAD6的过表达有效地抑制了细胞侵袭，在SMAD6表达水平高的ANXA10-KO细胞中观察到了相同的表型。相反，siRNA干扰介导的SMAD6的表达抑制恢复了ANXA10-KO细胞的侵袭能力。这些结果表明，ANXA10通过PKD1-SMAD6通路参与了黑色素瘤细胞迁移。

8、ANXA10-PKD1-SMAD6在黑色素瘤中的表达及其临床意义

为了确定ANXA10和SMAD6在黑色素瘤转移中的临床意义，作者使用Oncomine™对Xu黑色素瘤数据集(包括50例原发或转移浅表性黑色素瘤患者肿瘤样本的基因表达数据)进行生物信息学分析，评估它们表达之间的相关性。分析表明，在人类黑色素瘤中，ANXA10和SMAD6的表达水平呈负相关。此外，ANXA10的表达上调和SMAD6的表达下调与黑色素瘤转移相关。通过对患者黑色素瘤组织进行免疫组化染色，进一步验证了这些表达模式。根据患者的临床病理特征，将36例患者样本分为：原发性黑色素瘤(n=24)和转移性黑色素瘤(n=12)两组。免疫组化分析证实，与原发黑色素瘤相比，转移性黑色素瘤表现出较高的ANXA10表达，较低的SMAD6表达。此外，作者还观察到PKD1和ANXA10的表达趋势一致，在转移性黑色素瘤中比原发黑色素瘤中表达更高。因此，作者的数据表明，ANXA10-PKD1-SMAD6的表达模式在临床上与黑色素瘤转移有关。

研究结论
作者的结果表明，ANXA10在黑色素瘤中表达上调且与黑色素瘤的进展相关。机制上，ANXA10通过与PKD1结合并保护其免受TRIM41介导的泛素化作用，进而上调PKD1的蛋白水平；PKD1的表达上调抑制了SMAD6的表达；SMAD6的下调促进了E-cadherin到N-cadherin的转化；最终提高了黑色素瘤的转移能力。 在本研究中，作者确定TRIM41是一个可以降解PKD1的E3泛素连接酶，而ANXA10是一个新的PKD1相关蛋白，可以增强PKD1的稳定性。作为PKD1蛋白水平的调节因子，ANXA10和TRIM41可能是PKD1靶向黑色素瘤治疗策略中有意义的候选药物。ANXA10通过PKD1–SMAD6依赖途径促进黑色素瘤转移。ANXA10-PKD1-SMAD6表达模式在临床上与黑色素瘤转移相关。因此，对ANXA10-PKD1-SMAD6轴的研究将有助于开发新的黑色素瘤转移靶向治疗方法。

参考文献

Zhang, Xuerui, et al. "ANXA10 promotes melanoma metastasis by suppressing E3 ligase TRIM41-directed PKD1 degradation." Cancer Letters (2021).