研究背景

结直肠癌(CRC)是美国第三大致命癌症类型。目前结直肠癌的治疗方法有：手术切除、放疗和辅助化疗。5-氟尿嘧啶(5FU)是临床治疗结直肠癌的常规化疗药物，通过阻碍结直肠癌细胞的核苷酸代谢而诱导细胞死亡。然而，无论5FU是单独使用还是联合使用，随着治疗时间的增加，都会产生耐药。因此，迫切需要解决5FU的耐药或者寻求一种更有效的结直肠癌治疗方法。

糖代谢异常和耐药性紧密相关是肿瘤的一个标志。参与糖代谢的几个关键酶，包括PKM2、PDK1和IDH1，也参与了结直肠癌的发展和化疗耐药的发生。异柠檬酸脱氢酶1 (IDH1)催化底物异柠檬酸生成α-酮戊二酸(α-KG)，并伴随着NADPH的降低。与正常组织相比，IDH1在多种肿瘤中表达升高，包括骨肉瘤、肺癌或胃癌。IDH1的突变也与胶质瘤的发生和靶向治疗的耐药有关。作为IDH1的代谢物，α-KG是维持细胞质双加氧酶活性所必需的。NADPH参与了防御细胞的不良氧化反应，如化疗药物诱导的活性氧(ROS)。因此，IDH1及其相关代谢物有利于维持肿瘤的生存和恶劣的外部环境。目前，IDH1商业化抑制剂ivosidenib(AG-120)已应用于胆管癌和白血病的临床试验。IDH1在结直肠癌对5FU或其他化疗药物耐药发展中的作用尚不清楚。

外泌体是由多种类型的细胞分泌的纳米级细胞外囊泡，广泛参与细胞间的通信。它们将其内容物(包括DNA、RNA和蛋白质)从源细胞向受体细胞传递以提供指令。在肿瘤细胞中，外泌体参与了肿瘤发生、侵袭、免疫反应和化疗耐药，并调节肿瘤微环境。例如，乳腺癌细胞分泌的外泌体miR-105可以重编程与癌症相关的成纤维细胞的葡萄糖代谢以支持肿瘤生长；外泌体miR-128-3p增强了结直肠癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性。作者之前的研究发现，来自顺铂耐药肺癌细胞的外泌体传递PKM2，重编程敏感细胞内的糖代谢，并将耐药性传递给敏感细胞。在结直肠癌细胞中，外泌体在细胞代谢和耐药性发展中的参与机制尚不清楚。

研究路线

研究内容

1、IDH1高表达可预测结直肠癌的恶性进展

作者首先检测了IDH1在人类临床样本中的表达。应用免疫组化方法检测了125例结直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织中IDH1的表达，并对IDH1表达量进行定量统计分析。结果表明，IDH1在结直肠癌组织中高表达。进一步分析显示，结直肠癌患者的高分期与IDH1高表达评分显著相关(p=0.0152)。根据免疫组化评分，将125例结直肠癌患者分为高表达组（87例）和低表达组（38例），并进行临床指标相关性分析。结果表明，IDH1高表达与肿瘤高分期(p<0.001)、远处转移(p=0.006)和淋巴结转移(p=0.002)相关。因此，在结直肠癌患者中IDH1的高表达可能是恶性特征的一个指标。

2、IDH1促进了结直肠癌细胞的增殖和5FU耐药
接下来，作者探讨了IDH1对结直肠癌细胞系肿瘤生长的影响。在结直肠癌细胞系HCT8中稳定过表达Flag-IDH1。细胞增殖实验显示，IDH1的过表达能增强体外培养的HCT8细胞的增殖能力。同时，作者利用shRNA慢病毒质粒将IDH1稳定表达抑制，建立了两个HCT8细胞系(shIDH1-994和shIDH1-1404)。结果显示，IDH1表达抑制后，HCT8细胞增殖明显低于对照组。流式细胞术细胞周期分析显示，IDH1的过表达可降低G1期HCT8细胞比例，增加G2期HCT8细胞比例。与对照细胞相比，表达IDH1-shRNA的细胞中G1期细胞比例显著增加，S期细胞比例显著减少，说明IDH1的表达敲除抑制了结直肠癌细胞周期中的G1-S转化。

作者探讨了IDH1在结直肠癌化疗耐药发展中的作用。与对照载体相比，不同浓度(0.5和2 μg/ml) 5FU处理后，Flag-IDH1均能提高HCT8细胞的存活率，说明IDH1的过表达促进了5FU耐药的发展。细胞侵袭实验结果显示，IDH1表达敲除后，HCT8细胞侵袭能力下降，IDH1-shRNA联合5FU处理可以进一步抑制细胞的侵袭。这些结果证实IDH1促进了结直肠癌细胞的增殖和对5FU的耐药。IDH1的表达敲除联合5FU治疗可增强对结直肠癌细胞恶性行为的抑制作用。

3、5FU耐药的结直肠癌细胞分泌的外泌体可以诱导耐药

为了研究5FU耐药在结直肠癌中发生和传递的机制，作者建立了5FU耐药的HCT8细胞系：HCT8FU。用细胞活力法评估HCT8FU细胞对5FU的耐药性，结果表明，这些细胞对5FU的耐药性高于药敏的HCT8细胞系。作者试图确定外泌体是否参与结直肠癌细胞不同亚群之间的通信和5FU耐药性的传递。超速离心分离HCT8和HCT8FU细胞的外泌体(HCT8-exo和HCT8FU-exo)，并通过透射电镜观察其形态。Western blotting检测显示，外泌体标记物CD63和TSG101在HCT8-exo和HCT8FU-exo中表达，表明外泌体分离成功。纳米颗粒大小分析研究表明，这些外泌体的平均直径为100-250 nm。然后，40 μg/ml的HCT8-exo或HCT8FU-exo与敏感HCT8细胞共培养24到96小时，结果显示，HCT8FU-exo能显著促进HCT8细胞的增殖。用40 μg/ml HCT8-exo或HCT8FU-exo处理5FU敏感的HCT8细胞48小时，再用5FU处理48小时, HCT8FU-exo较HCT8-exo更能增强HCT8细胞的5FU耐药能力。这些结果表明，5FU耐药的结直肠癌细胞分泌的外泌体促进了结直肠癌敏感细胞的耐药性。

4、IDH1在5FU耐药的结直肠癌细胞分泌的外泌体中高表达

作者使用LC-MS/MS对敏感HCT8细胞(HCT8-exo)和耐药HCT8FU细胞(HCT8FU-exo)的外泌体进行了蛋白谱筛查，以获得两者的差异表达蛋白。采用iBAQ算法对蛋白进行绝对定量，HCT8-exo和HCT8FU-exo之间共鉴定出1629个差异表达蛋白。其中，HCT8-exo高表达的蛋白有95个，HCT8FU-exo高表达的蛋白有1534个。此外，对HCT8FU-exo高表达蛋白的KEGG富集分析表明，这些在5FU耐药外泌体中富集的蛋白参与了糖酵解和环境信息等代谢途径的调控。KEGG富集分析表明，在HCT8-exo中，免疫系统调节蛋白和代谢通路相关蛋白在敏感细胞来源的外泌体中高度富集。HCT8FU-exo高表达的蛋白包括IDH1等调节葡萄糖代谢的蛋白，而HCT8-exo高表达的蛋白参与了细胞代谢。LC-MS/MS的iBAQ绝对蛋白定量结果显示，IDH1在5FU耐药的结直肠癌细胞外泌体中高表达。Western blotting也显示HCT8FU-exo中IDHI的高水平表达。这些结果表明，外泌体IDH1可能参与了结直肠癌细胞5FU耐药的发生和传递。

5、外泌体IDH1促进结直肠癌细胞对5FU的耐受

用5FU暴露下的HCT8细胞的活力来确定来自耐药细胞的外泌体IDH1是否能在敏感细胞中诱导5FU耐药。从表达Flag-IDH1的HCT8细胞中分离出外泌体，外泌体中的IDH1过表达。IDH1高表达的外泌体(HCT8- exo^IDH1)和对照外泌体(HCT8-exo^vector)与HCT8细胞共培养，然后暴露于5FU。结果显示，IDH1高表达的外泌体显著促进HCT8细胞对5FU的耐药。从IDH1稳定下调的HCT8FU细胞(HCT8FU-exo^shIDH1-994和HCT8FU- exo^shIDH1-1404)中提取外泌体，并与HCT8细胞共培养。IDH1低表达的外泌体增强了HCT8细胞对5FU的敏感性。使用IDH1抑制剂ivosidenib治疗HCT8FU细胞，然后提取外泌体(HCT8FU-exo^ivosidenib)，提高了HCT8细胞的药物敏感性。总之，这些结果表明，耐药的结直肠癌细胞分泌外泌体，通过传递IDH1，使敏感细胞对5FU产生了耐药性。

6、外泌体IDH1介导的糖代谢重编程与5FU耐药有关

来自耐药细胞的外泌体传递了IDH1，加速了敏感细胞的葡萄糖代谢，从而达到5FU耐药。摄入HCT8FU-exo的HCT8细胞的葡萄糖消耗明显高于摄入HCT8-exo的细胞。与HCT8-exo相比，HCT8FU-exo还能增加HCT8细胞内α-KG的生成水平。异柠檬酸脱氢酶活性检测显示，摄入HCT8FU-exo的HCT8细胞中IDH1活性升高。IDH1调控细胞内还原代谢物NADPH的产生，之前的研究也表明NADPH可以中和化疗药物引起的肿瘤细胞损伤。在5FU耐药的HCT8FU细胞中，NADPH的水平高于敏感的HCT8细胞。5FU显著降低HCT8细胞中的NADPH水平，说明5FU的细胞毒性伴随着低水平的NADPH。当HCT8FU-exo与5FU处理的HCT8细胞共培养时，细胞内NADPH水平没有明显变化。为了逆转外泌体IDH1对NADPH生成的影响，作者使用5FU处理摄入了HCT8FU-exo^shIDH1-994、HCT8FU- exo^shIDH1-1404或HCT8FU-exo^ivosidenib的HCT8细胞。结果显示，5FU降低了与HCT8FU-exo共培养的HCT8细胞NADPH水平，HCT8FU-exo中的IDH1活性或含量受到抑制。为了逆转外泌体IDH1引起的耐药，作者使用了IDH1抑制剂（ivosidenib）和5FU共同处理细胞。与5FU相比，ivosidenib与5FU联合使用显著降低HCT8FU细胞NADPH水平。作者的数据证实，耐药细胞分泌含有IDH1的外泌体，增加了敏感细胞内的NADPH水平，进而引起耐药。