研究背景
肺癌是全球发病率和死亡率较高的疾病之一，非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌总病例的85%。非小细胞肺癌的预后改善虽然已取得了很大的进展，但由于肿瘤的侵袭性和转移性，治疗效果并不理想。
越来越多的数据表明，非编码RNA (ncRNAs)的异常表达与非小细胞肺癌的进展有关。环状RNA (circRNAs)是一种新的非编码RNA亚群，具有闭环结构、组织特异性和RNase R耐受的特点。研究表明，环状RNA可以海绵吸附miRNAs，并与蛋白质结合，促进蛋白质在癌症中的翻译。识别潜在的ncRNA可能为非小细胞肺癌的检测提供新的见解。
研究路线
研究内容
1、CircTUBGCP3的表达上调与肺腺癌患者的存活率低有关
作者使用circRNA芯片对肺腺癌和正常组织进行了差异分析，以2倍差异和P<0.02为筛选标准。结果表明，hsa_circ_0007031在肺腺癌组织中表达增加(差异28.101倍, p<0.0001)。依据circRNA interactome数据库分析，hsa_circ_0007031 源于TUBGCP3基因的外显子11和20，位于染色体13q34，剪接长度为972nt，故将其命名为circTUBGCP3。RT-qPCR检测结果表明，circTUBGCP3在肺腺癌组织中表达升高。在90例配对肺腺癌组织中的FISH分析也得到了同样的结果。
作者分析得到circTUBGCP3的cutoff值，并将病例分为circTUBGCP3高表达组和circTUBGCP3低表达组。分析表明，circTUBGCP3的表达升高与患者的年龄(P=0.030)和病理分期(P<0.0001)相关。circTUBGCP3高表达患者的生存期比circTUBGCP3低表达患者的生存期差。单因素和多因素分析表明，circTUBGCP3是肺腺癌患者预后不良的独立因素。
2、CircTUBGCP3在肺腺癌细胞中被鉴定为环状RNA
RT-qPCR结果显示，在A549和SPC-A1细胞系中，与线性TUBGCP3相比，circTUBGCP3对RNase R的消化产生耐受。将这两种细胞系暴露于放线菌素D（转录抑制剂）一段时间，RT-qPCR分析显示，circTUBGCP3的半衰期超过24 h，而线性TUBGCP3的半衰期为6 h。RT-qPCR和FISH分析显示，circTUBGCP3主要定位于肺腺癌细胞的细胞质中。
3、CircTUBGCP3促进了肺腺癌细胞的生长和侵袭
作者通过RT-qPCR检测了多个细胞系中circTUBGCP3的表达水平，结果表明，与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比，circTUBGCP3在NCI-H460细胞系中表达水平较高，而在A549和SPC-A1细胞系中表达水平较低。作者将circTUBGCP3质粒转染入A549和SPC-A1细胞，或将si-circTUBGCP3慢病毒转染入NCI-H460细胞，并通过RT-qPCR验证其效率。进一步的功能研究表明，在A549和SPC-A1细胞中，circTUBGCP3的过表达可以提高细胞的活力、集落形成和侵袭能力，而在NCI-H460细胞中，circTUBGCP3的表达敲除则逆转了这些作用。
4、CircTUBGCP3在肺腺癌细胞中可作为miR-885-3p的海绵分子
根据circRNA的表达数据和miRbase数据库，作者鉴定出5个miRNA (miR-885-3p、miR-640、miR-324-5p、miR-194-3p、miR-103a-3p)有可能与circTUBGCP3结合。荧光素酶报告基因检测表明，在HEK293T细胞中，与对照组相比，miR-885-3p mimic相对于其他四个候选miRNA对circTUBGCP3 3’UTR的荧光素酶活性下调最显著。作者设计了circTUBGCP3 3’UTR的野生型或突变型并进行荧光素酶报告基因检测。结果表明，与对照组相比，miR-885-3p mimic可以降低A549和SPC-A1细胞中野生型circTUBGCP3 3'UTR的荧光素酶活性，而非突变型。作者使用RNA结合蛋白免疫沉淀 (RIP)实验研究了circTUBGCP3与Ago2-miR-885-3p复合物的结合。对Ago2蛋白捕获的RNA进行RT-qPCR实验，以检测内源性circTUBGCP3和miR-885-3p在A549和SPC-A1细胞中的富集水平，结果表明，circTUBGCP3和miR-885-3p在Ago2捕获物中的富集水平高于对照 input。circTUBGCP3的异常表达降低了miR-885-3p的表达，但miR-885-3p mimic对A549和SPC-A1中circTUBGCP3的表达无影响。FISH实验显示circTUBGCP3与miR- 885-3p共定位于A549细胞的细胞质中。
作者在肺腺癌和癌旁组织中对miR-885-3p的表达进行了RT-qPCR检测，结果表明，miR-885-3p在肺腺癌组织中表达低，且与circTUBGCP3的表达呈负相关。作者在TCGA数据库中的分析进一步证实了miR-885-3p的下调。miR-885-3p的低表达与病理分期(P=0.006)和淋巴结转移(P=0.001)相关。mir-885-3p低表达患者的生存率低于mir-885-3p高表达患者。
5、MiR-885-3p逆转了circTUBGCP3引起的细胞生长和wnt10b信号的激活
作者通过RT-qPCR检测了miR-885-3p inhibitor在NCI-H460细胞中的抑制效率，以及miR-885-3p mimics在A549细胞中的过表达效率。进一步的功能实验表明，在NCI-H460细胞中，miR-885-3p抑制剂促进了细胞增殖和集落形成，并减弱了circTUBGCP3沉默诱导的肿瘤抑制作用，而miR-885-3p mimics在A549细胞中则表现出相反的作用。
通过TargetScan7.1软件分析，作者预测了野生型wnt10b 3'UTR与miR-885-3p之间关系及结合位点。功能实验表明，miR-885-3p抑制剂增加了野生型wnt10b 3’utr在NCI-460细胞中的荧光素酶活性，而miR-885-3p mimics在A549细胞中表现出相反的作用。通过分析TCGA数据，作者发现在wnt10b在59例配对和481例非配对肺腺癌组织中表达水平高于癌旁，且与肺腺癌组织中miR-885-3p的表达呈负相关。wnt10b的表达升高与肺腺癌患者的性别(P=0.002)和淋巴结转移(P=0.023)有关。wnt10b高表达的患者生存率低于低表达的患者。作者将si-wnt10B转染入NCI-H460细胞或将wnt10B质粒转染入A549细胞，并通过Western blot验证其效率。功能实验表明，wnt10B的表达敲除抑制了细胞的集落形成，但wnt10B的过表达促进了细胞的集落形成。此外，miR-885-3p的抑制剂使NCI-H460细胞中Wnt10b和β-catenin的表达上调，并抵消了circTUBGCP3的表达敲除所诱导的对Wnt10b/β-catenin信号激活的抑制作用，而miR-885-3p mimics在A549细胞中具有相反的作用。
6、CircTUBGCP3的表达敲除可以抑制肺腺癌的肿瘤发生
为了确定circTUBGCP3是否影响肺腺癌的体内成瘤，作者将si-circTUBGCP3或si-NC用慢病毒稳定转染入NC-H460细胞，然后将这些细胞皮下注射到裸鼠侧腹，构建裸鼠异种移植瘤模型。经过30天的观察，作者发现，si-circTUBGCP3组的肿瘤体积明显小于si-NC组，生长曲线显示，si-circTUBGCP3组肿瘤生长较慢。si-circTUBGCP3组的肿瘤重量也明显轻于si-NC组。HE染色显示，与si-NC组相比，si-circTUBGCP3组的肿瘤细胞增殖数量减少。免疫组化分析显示，与si-NC组相比，si-circTUBGCP3组Ki-67表达水平显著降低。
研究结论
circTUBGCP3的表达上调或miR-885-3p的表达下调与肺腺癌患者的病理分期和低生存率相关。circTUBGCP3的过表达促进了肺腺癌细胞的生长和侵袭。
在机制上，circTUBGCP3可作为miR-885-3p的海绵分子，上调其靶点Wnt10b的表达，从而促进肺腺癌的发展，circTUBGCP3的高表达可以预示肺腺癌患者的低存活率。
参考文献
Yang Y , Fan X , Nie Y , et al. CircTUBGCP3 facilitates the tumorigenesis of lung adenocarcinoma by sponging miR-885-3p. 2021.doi: https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-502804/v1.
