研究背景

胃癌(GC)是全球第五大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因，2018年约有782,685例患者因胃癌而死亡。早期诊断对于胃癌患者的治疗和改善其预后至关重要，但早期胃癌患者没有特异性症状，胃癌的诊断主要依靠内窥镜结合组织活检、影像学检查及血清肿瘤标志物的检测。组织活检是金标准方法，但组织病理学上有明显的视觉改变是滞后的。鉴定与胃癌发展密切相关的新的生物标志物，将有助于临床医生对胃癌进行早期风险评估、个体化治疗以及预测胃癌的生存时间。

环状RNA是RNA反向剪接过程中形成的稳定且保守的产物，广泛存在于多种人类细胞中。环状RNA是一种具有共价闭合环结构的非编码RNA (ncRNAs)，通过套索驱动或内含子配对驱动而形成环状结构。环状RNA参与了包括癌症在内的多种疾病的发病机制，并在转录、转录后和翻译水平调控基因表达。目前的研究表明，环状RNA可以通过其与miRNA的结合位点海绵吸附miRNA，从而促进或抑制肝癌的发生和进展。此外，circRNA比其他ncRNA具有更高的稳定性和组织特异性，且广泛分布于体液中。因此，circRNA可以作为胃癌潜在的分子生物标志物或早期诊断和有效治疗的靶点。

卷曲螺旋结构域6（CCDC6）最初在人甲状腺乳头状癌(PTC)中参与RET/PTC1融合基因而被识别。CCDC6基因的65kDa蛋白产物在几乎所有人体组织的细胞核和细胞质中均有表达。迄今为止，CCDC6已被鉴定为多种原癌基因的融合伙伴，如MYC、MLL、RARA、ALK和RUNX1，这些基因与CCDC6的融合大多数都会促进细胞增殖。CCDC6的卷曲螺旋结构域与RET的酪氨酸激酶结构域的融合被认为是晚期结直肠癌的一种新的致癌驱动因素。此外，CCDC6作为ROS1的融合蛋白，促进了致癌受体酪氨酸激酶的二聚和活化，这些也有可能会在胃癌中发生。

研究路线

研究内容

1、胃癌组织中的circRNA的表达谱和circDNA2的特征

作者对3例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织进行了去核糖体转录组测序，获得了环状RNA表达谱数据。作者共检测到3120个已在circBase网站上报道的环状RNA。83.62%(2609/3120)的检出环状RNA序列长度为小于1000bp，这与已报道的研究结果相似；转录组测序数据也显示95.96%(2994/3120)的检出环状RNA来自外显子。以表达差异两倍及P值小于0.05为差异筛选标准，相对于癌旁，胃癌组织中共有21个表达下调的circRNA和10个表达上调的circRNA。接下来，作者在20例胃癌组织和配对癌旁组织中进行了qRT-PCR验证实验，结果表明，circDNA2在胃癌组织中的表达水平较高(P<0.05)。与人胃粘膜细胞系GES-1相比，胃癌细胞系：AGS、SGC-7901和BGC-823中circDNA2的表达明显增加，其中AGS细胞中circDNA2的表达量最高，其次为SGC-7901细胞。

circDNA2源于DNA2基因，位于染色体10q 21.3上，DNA2基因的第2外显子和第5外显子(chr10:70218860-70229920)连接而形成环状结构。circDNA2的基因组序列长度为11060nt，其剪接长度约为645nt。circDNA2的qRT-PCR产物经Sanger测序证实为head-to-tail剪接结构。qRT-PCR结果显示，与无RNase R外切酶相比，AGS细胞中GAPDH的相对表达量降低了93.4倍，线性DNA2的相对表达量降低了45.0倍，circDNA2的相对表达量降低了1.4倍，这表明circDNA2对RNase R外切酶的耐受能力是同源线性基因DNA2的32倍，在SGC-7901细胞中也得到了类似的结果:circDNA2对RNase R外切酶诱导的消化的抗性是线性DNA2基因的38倍，表明circDNA2具有非线性的环状结构。接下来，作者检测了2mg/mL放线菌素D(一种转录抑制剂)处理后的circDNA2的稳定性，qRT-PCR检测显示，circDNA2转录本的半衰期超过24 h，而同源线性基因DNA2的半衰期仅约6 h，表明高度稳定的circDNA2具有作为诊断或预后生物标志物的潜力。此外，作者也分析了circDNA2的亚细胞定位和在胃癌组织中的表达水平。对AGS细胞和SGC-7901细胞的胞质和核RNA进行qRT-PCR检测，结果表明，circDNA2主要定位于两种细胞系的细胞质中。另外，作者通过FISH直接观察了circDNA2在胃癌组织和癌旁组织的细胞定位，结果表明，circDNA2主要在这两种细胞的细胞质中表达，并且胃癌组织细胞中circDNA2的表达高于正常组织细胞。综上所述，circDNA2是一种定位于细胞质的高度稳定的环状RNA，它与胃癌的诊断及预后的关系值得探索。

2、CCDC6增加了胃癌患者的微卫星不稳定性从而导致预后不良

作者首先分析了TCGA转录组测序数据库中的人类胃癌数据，并结合GTEx V8数据库中的正常胃数据，发现CCDC6在胃癌组织中的表达相对于癌旁组织显著增加。作者接下来检测了20例胃癌组织和配对癌旁组织中CCDC6的 mRNA表达，发现CCDC6在肿瘤组织中显著高表达。作者分析TCGA数据库中CCDC6的表达水平与胃癌患者的临床病理特征及预后的相关性，结果表明，CCDC6的基因表达水平与胃癌患者的微卫星不稳定性(MSI)评分显著正相关(P=0.016，ρ=0.12,95% CI 0.02-0.23,n=374)；而CCDC6的基因表达水平与胃癌患者的年龄、性别、病理分期、肿瘤大小、T分型、N分型、远处转移、病理分级均无显著相关性。

作者使用Kaplan-Meier plotter在线平台分析了胃癌患者的CCDC6表达与总生存期的相关性。结果表明，CCDC6高表达的胃癌患者总生存期和化疗后生存率较短。进一步的病理分期分析显示，CCDC6高表达的II期、III期、IV期胃癌患者的总生存期明显短于CCDC6低表达的患者。

3、miR-149-5p可作为circDNA2的海绵分子而靶向CCDC6基因

研究表明，miRNAs可抑制mRNA翻译或直接降解其靶点mRNA，从而在胃癌的发生发展过程中发挥关键作用。因此，作者使用StarBase v3.0在严格筛选条件下预测了靶向CCDC6基因3’UTR的潜在miRNA，候选的miRNAs在至少4种肿瘤类型中均有表达(≥5)，且在microT25和PITA26程序中均被预测到。已有研究表明，环状RNA海绵吸附miRNA而调控基因转录，进而参与肿瘤发生，作者利用CircInteractome数据库预测了可能被circDNA2海绵吸附的miRNA。预测结果显示，53个miRNA可以靶向CCDC6基因的3’UTR区, circDNA2可作为31个miRNA的海绵分子，两者取交集后，筛选出了两个miRNA：hsa-miR-149-5p和hsa-miR-375。进一步分析发现，miR-149-5p在胃腺癌组织中的表达与CCDC6呈显著负相关(R=-0.255, P<0.0001)。因此,作者利用TCGA的转录组数据分析了miR-149-5p的表达水平及其与CCDC6表达的相关性，分析结果表明，miR-149-5p在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织(n=389和41,P<0.0001)或配对癌旁组织(n=41和41,P=0.0034)，并与CCDC6的表达呈负相关。

作者使用CircInteractome数据库预测了circDNA2和miR-149-5p的潜在结合位点后，进行了双荧光素酶报告基因分析，以验证这两个分子是否可以直接结合。作者将构建的circDNA2片段插入荧光素酶报告基因下游，然后将荧光素酶报告基因与miR-149-5p mimic或inhibitor共转染入AGS细胞或SGC-7901细胞。结果表明，与对照组相比，miR-149-5p mimic组的荧光素酶活性下降，而miR-149-5p inhibitor组荧光素酶活性增强。作者接下来使circDNA2序列中的结合位点发生突变，并将突变的circDNA2与miR-149-5p mimic或inhibitor共转染到两种细胞系中，结果表明，与对照组相比，荧光素酶报告活性没有显著变化。RNA pull-down结果显示，在AGS和SGC-7901细胞中，与阴性探针结合物相比，circDNA2和miR-149-5p在circDNA2特异性的探针结合物中显著富集，证实了miR-149-5p与circDNA2的直接结合。此外，作者在胃癌组织细胞中进行了FISH实验，直观观察到了circDNA2和miR-149-5p之间的直接相互作用，发现这两个分子共定位于细胞质中。作者接下来的qRT-PCR实验结果表明，circDNA2在AGS细胞或SGC-7901细胞中过表达或敲除均负向调控miR-149-5p的表达，而miR-149-5p mimic和inhibitor对circDNA2的表达均无影响。接下来，作者在含80例配对胃癌样本的组织芯片中检测了circDNA2和miR-149-5p的表达水平及其表达相关性。结果表明，与癌旁组织相比，circDNA2在胃癌组织中相对表达较高，而miR-149-5p在胃癌组织中相对表达较低，两者的表达呈负相关(r=-0.1925, P<0.05)。

4、miR-149-5p可靶向CCDC6基因

作者检测发现，与GES-1细胞相比，miR-149-5p在AGS和SGC-7901细胞中的表达量较低，在AGS细胞中相对表达最低，而CCDC6在所有的胃癌细胞中的表达量都比较高。因此，作者将miR-149-5p mimic(60μM)转染到circDNA2高表达的AGS细胞中，将miR-149-5p inhibitor(80μM)转染到circDNA2低表达的SGC-7901细胞中。qRT-PCR和western blot检测结果显示，miR-149-5p mimic转染AGS细胞48小时后，miR-149-5p表达升高，CCDC6表达降低(P<0.001, P<0.01)；而转染了miR-149-5p inhibitor的SGC-7901细胞中，miR-149-5p表达降低，CCDC6表达升高(P<0.001, P<0.001)。接下来，作者在AGS和SGC-7901细胞中共转染miR-149-5p mimic（或inhibitor）和荧光素酶报告载体（野生或突变CCDC6 3' UTR）。检测结果表明，与对照组相比，CCDC6野生型和miR-149-5p mimic共转染的AGS细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.001)；而共转染CCDC6突变型和miR-149-5p inhibitor的SGC-7901细胞的荧光素酶活性显著升高(P<0.001)。有趣的是,共转染CCDC6突变型和miR-149-5p inhibitor组的荧光素酶活性与对照组没有差异(P>0.05)，而共转染CCDC6突变型和miR-149-5p mimic组的荧光素酶活性与对照组相比有减少(P<0.001)，这可能是由于CCDC6突变体和miR-149-5p有残留的结合位点。

5、circDNA2的表达敲除可降低体外胃癌细胞中CCDC6的表达并抑制其细胞增殖

作者设计了针对circDNA2反向剪接序列的一个过表达载体和一个siRNA干扰载体，将其分别转染入AGS和SGC-7901 GC细胞，并验证了其转染效率。进一步检测结果表明，circDNA2过表达组的CCDC6表达水平较对照组明显增强，而circDNA2表达敲除组的CCDC6表达水平较对照组明显降低。前期有报道CCDC6可促进肿瘤细胞增殖，基于上述研究结果，作者推测circDNA2可能通过海绵吸附miR-149-5p而增强CCDC6的表达，从而影响胃癌细胞的增殖。接下来作者进行了CCK-8、EdU和集落形成等功能实验综合评估胃癌细胞的增殖能力。结果表明，circDNA2的表达敲除可以抑制AGS细胞的增殖，而circDNA2的过表达可以增强SGC-7901细胞的增殖。此外，miR-149-5p的表达敲除恢复了circDNA2表达敲除诱导的AGS细胞的增殖抑制，而共转染miR-149-5p mimics逆转了circDNA2在SGC-7901细胞所引起的细胞增殖。

6、circDNA2和miR-149-5p的表达均与胃癌患者的淋巴侵袭和预后相关

作者评估了circDNA2和miR-149-5p的表达与78例胃癌患者的临床病理特征和预后的相关性。结果表明，胃癌患者的circDNA2表达与淋巴结转移呈正相关(N0+N1 vs N2+N3, P=0.0124)；circDNA2和miR-149-5p的表达与胃癌患者的其他临床特征均无显著相关性(P>0.05)。根据胃癌组织和癌旁组织中circDNA2和miR-149-5p的表达水平将患者分为高表达组和低表达两组，采用二元逻辑回归进行胃癌发生的风险评估分析。结果表明，circDNA2联合miR-149-5p评估胃癌发生率的曲线下面积(AUC)为0.7301(敏感性61.5%，特异性79.5%)，提示circDNA2和miR-149-5p可能是预测胃癌发生的生物标志物。

此外，作者没有发现circDNA2表达水平与胃癌患者的总生存期以及化疗后生存率有显著相关性。miR-149-5p低表达的胃癌患者比miR-149-5p高表达的胃癌患者总生存期更短。进一步的病理分期分析显示，miR-149-5p低表达的胃癌Ⅱ、Ⅲ期患者相对于高表达患者总生存和化疗后生存率明显较差。

研究结论

在本研究中，作者证实了CCDC6在胃癌组织和细胞系中的表达受circRNA的调控；机制上，circDNA2通过海绵吸附miR-149-5p，上调CCDC6的表达，从而促进胃癌的生长和淋巴转移。

circDNA2和miR-149-5p都具有成为胃癌诊断生物标志物的潜力。circDNA2作为生物标志物的优势在于它具有稳定的环结构；而miR-149-5p的优势在于它还可以预测胃癌患者总生存期和化疗后生存率；CCDC6亦是胃癌肿瘤发生的新靶点，与胃癌患者的微卫星不稳定和预后不良有关。故而，circDNA2/miR-149-5p/CCDC6轴可能成为胃癌的治疗靶点和预后监测指标。