1、BACH1在ESCC组织中高表达且与预后不良有关

为了探讨BACH1在食管鳞癌中的临床意义，作者采用免疫组化方法检测了BACH1在50例食管鳞癌组织及配对食管上皮组织中的表达。结果显示，BACH1在癌旁组织中表达弱或中等，在癌组织中表达中等或强。统计学分析表明，BACH1在ESCC组织中的IHC评分明显高于癌旁组织(P=0.0034)。作者接下来分析了TCGA数据库中ESCC组织数据集，结果显示，BACH1的mRNA表达水平在ESCC组织中的平均表达量显著高于癌旁组织(P=0.0344)。然后，作者基于TCGA-ESCC数据库分析了BACH1的mRNA表达水平与生存时间的关系。结果显示，与低表达组相比，高表达组患者的OS较差(P=0.0385)， DFS较短(P=0.0112)。总之，这些数据表明，BACH1可能在ESCC的进展中起关键作用。

2、BACH1在食管鳞癌细胞中的表达

作者使用Western blot和qPCR测定了BACH1在4种ESCC细胞系中的表达情况，结果表明，BACH1在KYSE30和KYSE170细胞中表达量较高，在KYSE150和KYSE510细胞中表达量较低；IF分析结果显示，BACH1表达定位于ESCC细胞的细胞核和细胞质中。因此，作者在KYSE30和KYSE170细胞中，使用两个siRNA对BACH1进行瞬时敲除；构建了BACH1稳定过表达的KYSE150细胞系，以及BACH1稳定敲除的KYSE170细胞系，来研究和验证BACH1的长期作用。作者通过qPCR和Western blot分析分别验证了BACH1基因的敲除和过表达效率。

3、BACH1增强了ESCC细胞在体外的迁移和侵袭能力

为了确定BACH1在ESCC中的功能作用，作者采用体外伤口愈合和Transwell实验检测了BACH1对ESCC细胞侵袭和迁移能力的影响。伤口愈合实验结果显示，BACH1的过表达显著增加了KYSE150细胞的迁移，而BACH1的敲除显著降低了KYSE30和KYSE170细胞的迁移。Transwell实验的结果表明，BACH1的过表达显著促进了KYSE150细胞的迁移和侵袭，而BACH1在KYSE30和KYSE170细胞的表达敲除抑制了细胞的迁移和侵袭，这些结果证实了BACH1在体外对ESCC细胞也有促进侵袭和转移的影响。随后，作者通过CCK和集落形成实验检测了BACH1对细胞短期和长期增殖的影响。结果表明，在KYSE170细胞中，BACH1的敲除抑制了短期细胞增殖；但BACH1的过表达不影响KYSE150细胞的增殖。BACH1对细胞的长期生长和存活无影响。因此，BACH1显著增强了ESCC细胞的肿瘤迁移和侵袭能力。

4、BACH1可诱导食管鳞状细胞癌细胞发生EMT

BACH1的过表达和敲除会导致ESCC细胞的形态改变。在KYSE150-BACH1细胞中，BACH1的过表达导致了从上皮细胞表型向间质细胞表型的明显形态转变，使用两种特定的siRNAs使BACH1表达下降导致了显著的上皮形态，一些KYSE170和KYSE30细胞显示了鹅卵石样形态。这些结果提示作者，BACH1是否参与了ESCC细胞EMT的诱导？作者通过qPCR和Western blot分别检测了一些EMT的标记蛋白：E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Slug的mRNA和蛋白表达，以论证BACH1对EMT的影响。结果表明，在KYSE30-siBACH1和KYSE170-siBACH1细胞中，BACH1的敲除抑制了N-cadherin、vimentin和Slug的表达水平，增加了E-cadherin的表达水平。相反，在KYSE150-BACH1细胞中，BACH1的过表达增加了N-cadherin、vimentin和Slug的表达水平，减少了E-cadherin的表达水平，这些结果表明BACH1诱导了EMT。 作者通过免疫组化进一步检测77例ESCC组织标本中N-cadherin、Slug和vimentin的蛋白水平，以研究它们与BACH1的表达相关性。卡方检验结果显示，BACH1蛋白的高表达与N-cadherin (P=0.0051)、Slug (P=0.0106)、vimentin (P=0.0431)的高表达呈正相关。因此，这些结果证实BACH1促进了ESCC的EMT。

5、BACH1在ESCC细胞中上调了CDH2转录水平的表达

6、BACH1上调VEGFC进而促进血管生成

血管的形成对肿瘤的扩张和转移很重要。先前的研究表明，BACH1在卵巢癌和大肠癌中通过调控VEGFC的表达而促进血管生成。因此，作者研究了ESCC中BACH1与VEGFC的相关性。首先，作者检测到在BACH1表达敲除的KYSE170-siBACH1和KYSE30-siBACH1细胞中VEGFC的mRNA表达水平下降。而在KYSE150-BACH1细胞中，VEGFC的mRNA表达水平升高，这与BACH1的表达增强有关。接下来，作者利用GEO数据(GSE23400)分析了ESCC中VEGFC的表达。ESCC组织中VEGFC的mRNA表达水平明显高于癌旁组织。TCGA-ESCC数据库的Spearman相关分析显示，VEGFC的mRNA表达水平与BACH1的mRNA表达水平呈正相关。此外，KYSE150和KYSE170细胞的ChIP-qPCR检测结果表明，BACH1能够与VEGFC的启动子区结合，并调控VEGFC的表达。由此可见，BACH1可以通过上调VEGFC的转录和促进血管生成而部分促进转移。

7、BACH1在体内促进ESCC细胞的增殖和血管生成
接下来，作者在体内检测了BACH1对肿瘤进展的长期影响。将KYSE170-shBACH1/KYSE170-shCtrl和KYSE150-BACH1/KYSE150细胞皮下注射到裸鼠侧腹，构建异种移植瘤模型，将移植瘤切除并进行检测。检测结果显示，来自KYSE170-shBACH1细胞的肿瘤比来自对照细胞的肿瘤小，由此可见，BACH1的表达敲除显著抑制了肿瘤的生长(P<0.01)；此外，来自KYSE150-BACH1细胞的肿瘤比来自对照细胞的肿瘤更大，故而BACH1的过表达促进了肿瘤的生长(P<0.01)。接下来，作者检测了EMT标记物在体内的表达，来自KYSE170-shBACH1和KYSE170-shCtrl细胞的异种移植瘤的免疫组化染色(IHC)结果表明，BACH1基因的表达敲除伴随着N-cadherin、vimentin和Slug在体内的低表达。

此外，作者对异种移植瘤中的血管内皮标记物CD31和VEGFC进行免疫组化和IF染色以评估血管生成。结果表明，与注射对照KYSE170-shCtrl细胞的小鼠相比，BACH1的表达下调显著抑制了皮下注射KYSE170-shBACH1细胞的小鼠移植瘤组织中CD31+血管密度和 VEGFC的表达。与注射KYSE150-Vector对照细胞的小鼠相比，BACH1的过表达显著增加了皮下注射KYSE150-BACH1细胞的小鼠移植瘤组织中CD31+血管密度。这些结果表明，BACH1在异种移植模型中通过促进血管生成和EMT部分地促进肿瘤生长。

研究结论

本研究揭示了BACH1在ESCC中重要的促转移、促血管生成和预后不良的作用。BACH1通过与EMT相关基因：CDH2、VIM、SNAI2和VEGFC的转录启动子区结合，增强了这些基因的转录，从而促进了ESCC的转移和血管生成。作者的研究结果表明，BACH1可能是食管鳞癌潜在的治疗靶点和预后生物标志物。