肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌的主要类型,已被证实为全球第二大癌症死亡原因,且发病率呈上升趋势。对HCC疾病发展的潜在分子机制的认识不足以及因此而缺乏有效的治疗是HCC预后不良的主要原因。尽管肝癌免疫检查点抑制剂的临床试验进展很好,但索拉非尼和乐伐替尼仍然是目前仅有的两种治疗晚期肝癌的一线选择。因此,鉴定肝细胞癌的功能调控因子和治疗靶点,对开发有效、新颖的抗肝细胞癌治疗方法具有重要意义。
选择性剪接(Alternative splicing, AS)是大多数真核生物基因都会涉及的一种转录后调控过程。不同的mRNA剪接异构体编码不同结构或功能的蛋白质亚型,从而使细胞的蛋白质组多样化。而在肿瘤细胞中,正常的可变剪接调控被扰乱,从而导致了肿瘤特异性RNA转录谱,进而促进了肿瘤细胞的增殖、迁移或逃逸细胞死亡。最近对多种实体瘤的大规模研究表明,这些肿瘤特异性剪接模式与剪接因子的失调有关,包括剪接调控基因的突变、拷贝数变异或表达改变。这些发现使研究者对肿瘤发展中的剪接因子的失调越来越感兴趣,旨在为癌症治疗提供新的治疗策略。
异常可变剪接在肝细胞癌中也很常见,且与肝癌的特征有关。此外,多种可变剪接调控因子已被报道参与了肝癌的进展,包括:SRSF2、SRSF3、hnRNPA2、PTBP3等。hnRNPU是一种重要的剪接调节因子,属于核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)家族,但其在HCC中的作用尚不明确。
研究路线
研究内容
1、hnRNPU在HCC中表达上调且与HCC患者的临床分期和预后相关
作者首先通过HCCDB(肝癌基因表达图谱)分析了hnRNPU在肝癌患者标本中 mRNA的表达,包括了268例HCC组织、243例癌旁组织、40例肝硬化组织和6例正常肝脏组织。与正常肝脏组织相比,肝硬化组织中hnRNPU表达水平升高,HCC组织中的hnRNPU表达更高。此外,与癌旁组织相比,HCC组织中hnRNPU的表达明显升高,同时,hnRNPU在癌旁组织中比正常肝脏表达略高。接下来,作者对包含58例肝癌样品的组织芯片进行免疫组化(IHC)染色来检测hnRNPU蛋白表达水平。结果表明,hnRNPU在肿瘤组织中具有强核染色,而在配对的癌旁组织中具有较弱或阴性核染色。hnRNPU染色强度的定量分析进一步显示,hnRNPU在肿瘤中的表达明显高于癌旁组织。此外,hnRNPU高表达的肝癌患者,TNM分期高且往往生存时间较短,这与人类蛋白质数据库的结果一致。这些结果表明,hnRNPU对HCC有潜在的预后价值。综上所述,作者证明了hnRNPU的表达升高可能在HCC的进展中发挥重要作用。
2、hnRNPU调控肝癌细胞的增殖、耐药和化疗诱导的凋亡
细胞增殖和凋亡的失调一直被认为是癌细胞的特征,作者接下来研究了hnRNPU是否参与了这些过程的调控。作者建立了两株 hnRNPU稳定敲除的HCC细胞系,并通过western blot (WB)验证了敲除效果。结果表明,hnRNPU基因敲除显著减缓了肝癌细胞的增殖,也降低了肝癌细胞对化疗药物阿霉素(Dox)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐药性。此外,Dox或5-FU可诱导凋亡标志物:剪接活化的caspase-3在肝癌细胞中发生低表达,而hnRNPU的下调可导致剪接活化的caspase-3的进一步积累,提示hnRNPU的下调减弱了肝癌细胞对化疗的凋亡耐药性。在hnRNPU过表达的HCC细胞中也得到了类似结果。结果表明,hnRNPU的过表达可促进肝癌细胞的增殖、耐药和化疗诱导的凋亡耐药。
3、hnRNPU调控肝癌细胞的自我更新和致瘤潜能
肝癌细胞的自我更新是肿瘤发生发展的关键过程,作者进一步研究了hnRNPU在肝癌细胞自我更新中的调控作用。结果表明,与scrambles对照相比,hnRNPU的基因敲除显著降低了肝癌细胞的集落形成能力。hnRNPU在肝癌细胞中基因敲除后,肝癌干细胞表面标志物CD133表达下调,而hnRNPU的过表达则增加了肝癌细胞中CD133的表达率。通过三维肿瘤球聚体(一种在体外富集和维持干细胞样细胞的方法)实验,作者进一步证实了hnRNPU在肝癌细胞的肿瘤球形成潜能方面发挥了重要作用。这些结果表明,hnRNPU在体外调控肝癌细胞的自我更新。此外,在有限稀释试验中,作者将106/105/104个PLC-scramble细胞和相同数量的PLC-hnRNPU敲除细胞分别移植到NOD/SCID小鼠的左右侧。4周后,计算肿瘤发生率,用ELDA软件分析肿瘤起始细胞的频率。scramble组和敲低组的起始肿瘤细胞频率分别为1/318005和1/1089636,提示hnRNPU的敲除显著降低了肝癌细胞的致瘤潜能。这些结果表明,hnRNPU在体外和体内均能调控肝癌细胞的自我更新。
4、c-Myc在转录水平调控hnRNPU而hnRNPU维持c-Myc的mRNA稳定
为了了解hnRNPU在HCC进展中的上调原因,作者首先分析了TCGA-LIHC样本中hnRNPU的基因表达情况,结果表明,只有少数病例hnRNPU mRNA的高表达可能与基因组扩增有关,而大多数病例不相关。因此,作者接下来从hnRNPU的转录调控中寻找证据。作者在hnRNPU的启动子区发现了几个c-Myc结合位点(E-box序列),而c-Myc已被广泛证明与癌症中的剪接体和异常剪接相关。HNRNPA1、HNRNPA2、PTB、SRSF1、PRMT5等剪接因子已被证明为c-Myc的直接转录靶点。因而作者推测,hnRNPU可能是肝癌中c-Myc的一个新的潜在转录靶点。因此,作者采用双荧光素酶报告基因技术来检测c-Myc对hnRNPU的转录调控作用。在转入pCDH-c-Myc后,hnRNPU启动子(-2197至-1664bp,包含三个E-box序列)的荧光素酶活性上调,而c-Myc抑制剂10058-F4和10074-G5的加入使荧光素酶活性进而下调。已知的c-Myc靶基因:hnRNPA1的启动子在该实验中作为阳性对照。这些结果表明,c-Myc可能在调控hnRNPU转录方面发挥着积极的作用。作者通过染色质免疫沉淀(ChIP)实验,证实了c-Myc可以与hnRNPU的启动子区域结合。此外,c-Myc的抑制剂在mRNA水平和蛋白水平均可以下调hnRNPU的表达,而c-Myc的过表达促进了hnRNPU的表达。以上结果表明,c-Myc在HCC细胞中是hnRNPU的正向转录调控因子。
此外,有报道称hnRNPU通过与IGF2BP1以RNA依赖的方式结合稳定c-MYC的mRNA,作者接下来检测了hnRNPU是否在HCC细胞中调控c-MYC mRNA的稳定性。作者将hnRNPU的表达敲除,并在放线菌素D(一种转录抑制剂)处理后,在指定时间测量c-MYC mRNA的表达水平。结果显示,在hnRNPU基因敲除的Hep3B细胞中,c-MYC的mRNA在放线菌素D处理4小时后表达下调速度快于hnRNPU-normal Hep3B细胞;而放线菌素D处理8小时后,hnRNPU基因敲除的肝癌细胞中c-MYC的mRNA表达下降速度明显高于对照组。相应地,在hnRNPU基因敲除的HCC细胞中,c-Myc蛋白表达水平降低,而在hnRNPU基因过表达的HCC细胞中,c-Myc蛋白水平升高。这些结果提示,hnRNPU可稳定c-MYC的mRNA,调节其蛋白表达。
5、hnRNPU与c-Myc在HCC样本中的表达呈正相关
对TCGA-LIHC数据集中的临床HCC患者数据分析表明,c-Myc与hnRNPU在mRNA的表达水平呈正相关。作者在15例原发性HCC样本中检测,结果表明,二者的蛋白水平也呈正相关。有趣的是,作者发现在2号患者癌旁组织的阴性染色背景中发现了c-Myc和hnRNPU过表达的微转移灶。这一发现进一步证实了这两种蛋白在HCC中的密切相关性。
6、hnRNPU过表达可部分消除肝癌细胞中c-Myc抑制剂的作用
c-Myc是一种强致癌基因,通过调节一些下游信号通路来维持癌细胞的生存和自我更新,而且c-Myc和hnRNPU之间存在相互调控。作者接下来研究了hnRNPU在肝癌细胞中c- myc介导的生物学过程中扮演什么角色。作者使用c-Myc抑制剂阻断了c-Myc介导的生物学功能,并检测了hnRNPU过表达对c-Myc功能抑制的影响。在肝癌细胞中引入外源性hnRNPU,作者发现,hnRNPU的过表达部分消除了10058-F4和10074-G5的生长抑制作用。hnRNPU过表达细胞的集落形成能力也对c-Myc抑制剂表现出更高的耐药性。此外,10058-F4或10074-G5显著降低了肿瘤球的数量和体积,而hnRNPU的过表达部分逆转了这两种c-Myc抑制剂所引起的自我更新抑制。不仅如此,在10058-F4或10074-G5处理的肝癌细胞中,在48小时内可诱导剪切活化的caspase-3表达,而hnRNPU过表达可抑制剪切活化caspase-3的诱导,说明hnRNPU的过表达可很大程度挽救c-Myc抑制剂诱导的肝癌细胞凋亡。
上述结果表明,hnRNPU在肝癌细胞中过表达可部分恢复c-Myc抑制剂的增殖、自我更新抑制作用和诱导凋亡作用,提示hnRNPU在c-Myc介导的肝癌细胞生物学过程中发挥重要作用。
7、c-Myc的过表达可部分逆转肝癌细胞中hnRNPU基因敲除的影响
既然hnRNPU在肝癌细胞中参与了c-Myc介导的生物学作用,c-Myc是否也会影响hnRNPU在肝癌细胞中的生物学作用呢?作者接下来探讨了c-Myc的过表达对hnRNPU敲除的肝癌细胞生物学功能的影响。将c-Myc过表达载体(pCDH-RFP-c-Myc)、hnRNPU敲除载体(pScioR-GFP-sh-hnRNPU)及相应的对照载体(pCDH-RFP-NC/ pScioR-GFP-scramble)转染入肝癌细胞,流式细胞技术对转染的细胞富集,并进行western blot验证。结果表明,c-Myc的过表达也能部分逆转hnRNPU基因下调对细胞增殖、集落形成和肿瘤球形成的抑制作用。结果证明了c-Myc部分参与了hnRNPU介导的HCC细胞的生物学功能。
研究结论
作者发现hnRNPU在HCC组织中高表达,且与HCC患者的预后不良有关。此外,hnRNPU在调控肝癌细胞的增殖、凋亡、自我更新和致瘤潜能方面具有重要意义。机制上,c-Myc在转录水平调控hnRNPU的表达,同时hnRNPU稳定c-Myc的mRNA。作者发现hnRNPU和c-Myc调控环对肝癌的增殖和自我更新具有协同作用,并促进肝癌的进展。综上所述,hnRNPU作为一个新的c-Myc转录靶点,促进肝癌的进展,这可能成为治疗c-Myc驱动的肝癌的一个有前途的靶点。
参考文献
Zhang B, Wang H Y, Zhao D X, et al. hnRNPU Functions as a Novel Therapeutic Target of c-Myc in the Progression of Hepatocellular Carcinoma[J]. FEBS Letters, 2020.