研究背景

乳腺癌是妇女最常见的恶性癌症，发病率和死亡率都很高，据报道，2020年的新增病例约为230万例，死亡病例约为68.5万例。大多数乳腺癌的死亡都与远端转移有关，如：肺转移。转移性乳腺癌(mBC)患者大多是在初次治疗后复发的早期乳腺癌患者，部分为新生转移。转移性乳腺癌基本上是一种不治之症，5年生存率约为23.8-30%。因此，了解乳腺癌转移的潜在机制对于开发有效的治疗方法至关重要。

肿瘤抑制因子p53是一种序列特异性的DNA结合转录因子，调控细胞周期阻滞、DNA修复和凋亡等多种细胞功能的相关基因表达。在乳腺癌中，p53通过上调GAS7而抑制转移。p53在侵袭性乳腺癌中经常发生突变，约25-30%的乳腺癌患者，约80%的三阴性乳腺癌(TNBC)患者会发生P53突变，而p53突变的三阴性乳腺癌患者通常预后较差。进一步剖析和确认潜在的p53靶点将有利于转移性乳腺癌的诊断和治疗。

细胞粘附分子(CAMs)是一种膜糖蛋白受体，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用，并为细胞粘附、迁移、侵袭和器官特异性转移传递胞内信号。细胞粘附分子包括：钙粘蛋白、选择素、整合素、免疫球蛋白超家族(IgSF)等。2000年首次克隆的免疫球蛋白超家族9 (IGSF9)是IgSF的成员。研究表明，IGSF9在不同癌症类型中异常表达，如：在黑色素瘤、结直肠家族性腺瘤性息肉病中表达下调；在胆囊癌、卵巢癌和子宫内膜癌中表达上调。目前，IGSF9的表达和肿瘤之间的分子机制仍然不清楚，尤其在乳腺癌中。

局部黏着斑激酶(FAK)是一种非受体酪氨酸激酶，作为信号激酶和细胞粘附相关的支架来协调不同细胞骨架相关蛋白paxillin和p130Cas的位置募集和磷酸化。FAK还可与整合素或生长因子受体结合，调控细胞运动、侵袭和存活。有研究表明，FAK参与了肿瘤的发展和进展。FAK在侵袭性或转移性乳腺癌中过表达和激活，与乳腺癌进展和预后不良相关；FAK在乳腺上皮细胞中表达缺失可以抑制肿瘤的形成和转移。

研究路线

研究内容

1、p53在乳腺癌中反式激活IGSF9

P53作为一种转录因子，可调节细胞周期、衰老和凋亡等重要的细胞活动。作者利用JASPAR数据库预测了p53的最佳转录结合位点的特征，然后用Chip Atlas、hTFTarget、GTRD和Harmonizome对p53的潜在靶基因进行预测，得到1795个共同的靶基因。GO和KEGG富集分析表明，这些潜在基因主要涉及：粘着斑通路、粘附连接等。作者也利用Metascape进行GO功能和KEGG通路富集分析，探索靶基因的主要功能和通路。这些数据表明，p53调节细胞粘附相关基因(CAMs)。考虑到IGSF9是CAMs的成员，也是p53的潜在靶点(数据来自GTRD数据库)，作者进一步利用GeneMANIA构建了TP53和IGSF9的网络，从不同方面探讨了它们之间的相互作用。

作者对TCGA数据集进行分析，以探索p53和IGSF9之间的关系。分析表明，TP53与IGSF9在乳腺癌中的mRNA表达水平呈正相关(Pearson R=0.17, P<0.001)。与正常乳腺细胞MCF-10A相比，p53和IGSF9均在乳腺癌细胞MCF-7中表达下调，提示p53在调控乳腺癌中IGSF9的表达方面具有潜在作用。在结合位点两侧(−3000/+50 bp)设计PCR引物并进行染色质免疫沉淀(ChIP)试验。结果表明，p53可以与IGSF9的启动子结合。

为了进一步确认p53对IGSF9基因表达的调控作用，作者采用荧光素酶报告基因检测一系列IGSF9-luc报告基因（覆盖了启动子区：-3000至+50 bp）的转录活性。结果表明，−183/−116 nt序列启动子活性最高，该区域包含p53结合位点(−137/−131 nt)；p53结合位点的缺失和突变显著降低了IGSF9启动子的活性；p53蛋白显著增加了IGSF9的转录活性，而TP53蛋白的表达敲除显著降低了IGSF9的转录活性。同时，TP53的表达敲除显著降低了MCF-7细胞内源性和外源性IGSF9的表达。这些结果表明，p53通过与IGSF9的启动子结合而反式激活IGSF9。

文献表明，R175H、Y220C、G244D、G245S、R248Q、R249S、R273H、R282W等p53的DNA结合域在乳腺癌中的突变频率较高。作者构建了包含这些突变的序列，并进行了荧光素酶活性检测。结果表明，R175H消除了p53反式激活的IGSF9启动子活性，而其他突变没有这种效果。接下来，作者在MCF-7细胞中检测IGSF9的蛋白表达，发现野生型p53的过表达显著增加了IGSF9的蛋白水平，而突变型R175H不影响IGSF9的表达，其他p53突变体对IGSF9的蛋白增加与野生型p53相似。这些数据证实了，野生型p53直接与IGSF9启动子结合并激活IGSF9的表达，而R175H的突变可使这种效果消失。

2、IGSF9的表达缺失与乳腺癌的转移和不良预后有关

作者采用qRT-PCR对28对乳腺癌肿瘤及癌旁组织中IGSF9的mRNA表达进行了检测。结果表明，IGSF9在75%(21/28)乳腺癌肿瘤中的表达明显低于对应的癌旁组织。western blot分析同样表明，IGSF9在乳腺癌肿瘤中显著下调(P<0.001)。此外，作者收集了160对癌与癌旁配对的乳腺癌标本（手术切除术）进行免疫组化染色。结果表明，IGSF9在细胞内分散分布，与癌旁正常乳腺上皮细胞相比，乳腺癌肿瘤细胞中的IGSF9表达明显下调。

为了评估IGSF9的表达在乳腺癌中的临床意义，作者对IGSF9的表达进行了评分，并根据IGSF9蛋白中位表达水平将患者分为IGSF9高表达组和低表达组。分析表明，IGSF9的低表达与淋巴结转移(P=0.023)和TNM分期(P=0.030)显著相关，而与年龄、肿瘤大小和肿瘤分化无关。在GSE16446数据集中，作者发现与IGSF9高表达的乳腺癌患者相比，IGSF9低表达的乳腺癌患者无复发生存期(RFS)较差(P=0.037)，总生存期(OS)较差(P=0.019)。这些数据表明，IGSF9的表达降低与乳腺癌患者预后不良和转移有关，可能是乳腺癌患者的一个有价值的预后不良指标。

3、IGSF9的拷贝数和突变不影响其mRNA的表达水平

基因改变和表观遗传失活是抑癌基因表达缺失的两个主要原因。为了探索IGSF9在乳腺癌中的基因组改变，作者分析了来自cbiopportal数据库(2012-2021年)中的9555例乳腺癌病例的序列。结果表明，IGSF9拷贝数变化频率为0-21.26%，均为扩增。此外，cBioportal数据库中只有5/16的研究表明IGSF9可能发生突变，IGSF9在这些数据集中的突变的频率均小于3%。IGSF9基因拷贝数的轻度丢失并未造成其mRNA表达的明显下降。这些数据表明，基因拷贝数不是乳腺癌中IGSF9表达水平降低的主要因素。IGSF9的突变模式如下图所示，其中4个突变被多态表型分析工具预测为有害的。COSMIC分析显示，IGSF9启动子中包含p53结合位点的区域没有突变。IGSF9突变的mRNA表达在三个指示数据集中均匀分布，说明IGSF9的突变不影响其在乳腺癌中的mRNA表达水平。

4、蛋白酶体介导的降解可能导致IGSF9在乳腺癌细胞中表达降低

5、IGSF9的缺失促进乳腺癌转移

为了研究IGSF9在乳腺癌细胞增殖和转移中的作用，作者将IGSF9在MCF-7和T47D细胞系中稳定过表达，在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中表达敲除。western blot验证了IGSF9蛋白水平的过表达和干扰效率。CCK-8增殖和集落形成试验都表明，IGSF9过表达或敲低对细胞的增殖能力均没有影响。然而，伤口愈合和transwell迁移实验结果表明，IGSF9的过表达抑制了MCF-7和T47D细胞的迁移，而IGSF9的表达敲除促进了MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的迁移。transwell侵袭试验一致表明，IGSF9的过表达导致细胞侵袭能力显著降低，而IGSF9的表达敲除导致乳腺癌细胞侵袭能力增强。这些数据表明，IGSF9的表达缺失促进了乳腺癌的体外转移。此外，IGSF9的过表达抑制了TP53表达敲除所诱导的MCF-7细胞得迁移和侵袭，提示IGSF9可以恢复TP53表达敲除所诱导的乳腺癌转移。

6、IGSF9抑制了乳腺癌细胞的上皮间质转化过程

上皮间质转化（EMT）在乳腺癌、结直肠癌等上皮源性肿瘤中促进肿瘤的侵袭转移，起着重要且复杂的作用。作者对IGSF9表达下调的乳腺癌细胞进行western blot和免疫荧光分析，检测到了典型的EMT表型，即：E-cadherin和ZO-1表达下调，N-cadherin和MMP2表达上调。相反，在IGSF9过表达的乳腺癌细胞中，EMT表型被抑制。作者通过尾静脉注射乳腺癌稳定细胞悬浮液构建了肺转移模型。肺转移结节的Micro-CT和HE染色均证实，IGSF9表达敲除的MDA-MB-231细胞导致了肺转移负担增加。

7、IGSF9通过与FAK的FERM结构域相互作用而抑制FAK/AKT信号通路

为了探索IGSF9抑制肿瘤的潜在分子机制，作者分析了GSE27830数据集中IGSF9高表达和低表达样本间的差异表达基因，并对差异基因进行KEGG富集途径分析。分析表明，富集通路主要包括：粘着斑、PI3K-AKT信号通路、ECM受体相互作用和细胞粘附分子。

文献表明，FAK作为信号激酶和细胞粘附相关的支架蛋白参与了乳腺癌转移。IGSF9的结构使其能够作为一种潜在的细胞表面受体，并将外界信号转导入细胞内。免疫荧光显示，IGSF9和FAK在细胞内共定位。此外，免疫共沉淀实验显示，IGSF9和FAK在MCF-7细胞和HEK-293T细胞中分别存在内源性和外源性相互作用。为了确定FAK中与IGSF9相互作用的区域，作者将各种HA标记的FAK片段与IGSF9共表达，并进行免疫共沉淀实验。结果表明，含有FERM域的FAK (1-355 aa)可以与IGSF9结合。同时，作者还将FAK与各种Myc标记的IGSF9片段共表达。结果表明，含有5个Ig域的IGSF9 (1-493 aa)可以与FAK结合。体外翻译的IGSF9 (1-493 aa)可以被纯化的GST-FAK (1-355 aa)融合蛋白下拉，表明IGSF9 (1-493 aa)和FAK (1-355 aa)可以直接相互作用。根据蛋白质数据库中的x射线晶体结构预测了IGSF9-FAK的复合物结构模型。对接建模数据表明，IGSF9的R6、L63、L64、D80、E101和R109氨基酸以及FAK的S269、H292、L293和E325氨基酸是二者相互作用的关键。作者在IGSF9过表达或表达敲除的细胞中研究了FAK/AKT通路关键分子的活性。结果表明，p-FAK (Y397)、p-AKT (S473)和p-AKT (T308)在IGSF9过表达的MCF7和T47D细胞中显著降低，表明FAK/AKT信号通路受到抑制。相反，FAK/AKT信号通路在IGSF9表达敲除的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中被激活。这些结果表明，IGSF9与FAK相互作用并抑制FAK/AKT信号通路。

8、FAK抑制剂：PND1186在体内外均能抑制IGSF9表达敲除引起的乳腺癌转移

作者使用特异性FAK抑制剂：PND1186处理MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞。Western blot分析表明，IGSF9表达缺失所介导的FAK/AKT信号激活，可以被PND1186明显阻断。Transwell迁移和侵袭实验还表明，PND1186能显著逆转IGSF9表达敲除所诱导的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的迁移和侵袭。此外，作者通过将MDA-MB-231细胞尾静脉注射到4-6周雌性NOD-SCID小鼠，建立了肺转移模型。6周后处死小鼠，肺组织切片进行HE染色。肺转移灶数量表明，IGSF9的表达敲除加速了肿瘤转移，PND1186的处理可以逆转肿瘤转移。这些数据表明，IGSF9的表达缺失通过激活FAK/AKT信号而诱导乳腺癌转移。PND1186可能在未来应用于乳腺癌的治疗。

研究结论

作者发现IGSF9是一个新的p53靶点，野生型p53通过与IGSF9的启动子结合而反式激活其转录活性。IGSF9的表达缺失与乳腺癌转移和预后不良相关。在机制上，IGSF9的表达缺失通过激活FAK/AKT信号，进而促进EMT过程，从而导致乳腺癌转移。

本研究表明，IGSF9是一个可行的预后生物标志物，IGSF9/FAK轴可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。同时，作者也证明了，FAK抑制剂：PND1186在体内外均能抑制IGSF9的表达敲低所引起的乳腺癌转移。

参考文献

Li, Y., Deng, Y., Zhao, Y. et al. Immunoglobulin superfamily 9 (IGSF9) is trans-activated by p53, inhibits breast cancer metastasis via FAK. Oncogene (2022). https://doi.org/10.1038/s41388-022-02459-8